專利名稱：間充質干細胞在干燥綜合征中的應用的制作方法
技術領域：
本研究涉及人臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs)抑制干燥綜合征(SjGgren's Syndrome，SS)患者T細胞的免疫調節功能及其在SS 小鼠中的治療作用。
背景技術：
MSCs是一類具有多向分化潛能的組織干細胞，可從血液、肝臟、骨髓、脂肪、皮膚等 多種組織獲得，是一群多潛能細胞，可以向多種組織細胞如骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪 等分化。目前，MSCs主要來源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且隨 著年齡增長其細胞數量和擴增、分化能力出現明顯下降趨勢，故尋找一種能替代骨髓MSCs， 并可彌補其缺陷的MSCs來源，已越來越受到各國學者的關注。其他方法如從臍帶血和外周 血中培養MSCs具有一定難度，且MSCs在足月分娩的臍帶血或動員的外周血中數量尚存在 爭議。因此，從分娩后的廢棄材料臍帶中分離培養UCMSCs，為MSCs的應用提供了新的材料 來源和基礎資料。SS是一種以侵及淚腺和唾液腺等外分泌腺為特征的全身性自身免疫疾病。該病最 常見的臨床表現為眼干、口干，并可累及肺、腎臟、淋巴系統、血管及肝臟等器官。此病無明 顯的地區分布差異，可發生于任何年齡，以40-60歲，特別是絕經后的女性居多，男女之比 為1 :9。在我國的患病率為0.77%，在老年人群中的患病率高達4%，全國有近1000萬患 者。現有SS的治療方法包括傳統的免疫抑制劑及生物制劑，存在副作用大、價錢高等弊端， 為此需要不斷尋求更經濟有效且無明顯副作用的治療方法。NOD小鼠是目前國際上比較公 認的SS自發鼠模型。已有的研究證實，MSCs具有免疫調節功能，多項研究表明MSCs可抑制 多種自身免疫病患者T細胞的增殖及炎性細胞因子的分泌。為此，本課題組利用UCMSCs在 體外與SS患者T細胞共培養，并將UCMSCs移植到NOD體內，觀察UCMSCs在SS治療中的作 用。發現UCMSCs可抑制T細胞的免疫功能并明顯改善了 NOD的唾液流率及組織病理。為 UCMSCs治療SS的臨床應用提供依據。

發明內容
本研究利用UCMSCs在體外與SS患者T細胞共培養，并將UCMSCs移植到NOD小鼠 體內，觀察其在SS治療中的作用。發現UCMSCs可抑制T細胞的增殖，抑制炎性細胞因子 (TNF- α、IL-6、IFN- γ )的分泌，上調IL-10的表達，上調CD4+F0XP3+Treg細胞的表達，并明 顯改善了 NOD的唾液流率及組織病理。為UCMSCs治療SS的臨床應用提供依據。


圖1. UC-MSCs的鑒定㈧UCMSCs形態特征(第三代)⑶流式細胞術細胞表型 分析(C) :UCMSCs的脂肪誘導分化-油紅0染色(D) :UCMSCs的成骨誘導分化-堿性磷酸酶 染色
圖2. UC-MSCs對NOD小鼠的治療作用(A)無論在4周及8周給藥，UC-MSCs均能 明顯抑制NOD小鼠唾液流量的下降，*P < 0. 05，< 0. 01 (B)無論在4周及8周給藥， UC-MSCs均能明顯降低NOD小鼠血清中SS相關抗體的表達，*P < 0. 05，**P < 0. 01 (C)組 織病理學顯示，UC-MSCs能明顯改善NOD小鼠頌下腺灶性淋巴細胞的浸潤圖3. UC-MSCs對NOD小鼠的脾臟單個核細胞(MNCs)的免疫調節功能(A) =UCMSCs 治療組麗Cs的增殖能力較PBS組明顯降低，< 0.01 (B) =UCMSCs治療組麗Cs中調節性 T細胞(Treg)的表達較PBS組明顯上調，*P < 0. 05(C)在體外，將未干預的16周齡NOD 小鼠麗Cs與UCMSCs共培養，可見UCMSCs能明顯上調Treg的表達，**P < 0. 01圖4. UC-MSCs對NOD小鼠細胞因子分泌的影響(A) =UC-MSCs可下調NOD小鼠血 清中IL-6的表達，< 0. 01 (B) =UCMSCs治療組與PBS組相比，MNCs細胞上清中IL-6表 達下調，IL-10表達上調，< 0.01(C)在體外，將未干預的16周齡NOD小鼠MNCs與 UCMSCs共培養，可見UCMSCs能明顯下調TNF-α、IFN-γ的表達，上調IL-10的表達，**Ρ
<0. OIUC-MSCs對SS患者T細胞的影響(A) =UC-MSCs可抑制T細胞的增殖，并呈劑量依 賴性，*Ρ < 0. 05，< 0. 01 (B)抗IL-10單抗可逆轉UC-MSCs對T細胞增殖的抑制作 用，#P< 0.01(C):優1^08與1~細胞共培養，可下調1順-0的表達，上調IL-10的表達，*Ρ
<0. 05 (D) =UCMSCs能明顯上調SS患者Treg的表達，*Ρ < 0. 0具體實施例方式實施例1 臍帶間充質干細胞的分離、培養。a.取正常陰道分娩或剖腹產臍帶，經過嚴格檢測程序(ABO/Rh血型檢測，HLA分型 檢測，梅毒抗體檢測，HIV免疫檢測，CMV抗體檢測，乙型肝炎抗原抗體檢測)確定安全后，無 菌生理鹽水沖洗去除肉眼可見污物及血液。 b.無菌手工剪臍帶至3-5mm大小。c.將步驟b中獲得的組織塊，轉移入50ml離心管中，加入含青鏈霉素的 PBS40ml，室溫離心250g 5分鐘，棄上清。d.步驟c所獲組織塊用10% α MEM培養，每3天換液。e.至7天左右組織塊周圍有梭形及多角形細胞爬出，且逐漸增多。f.至10-14天左右細胞達80%左右融合時，用0. 25%胰酶消化傳代。g.以后每隔3-5天傳代一次。h.至第三代鑒定。i.經鑒定后的細胞繼續培養備用或凍存。見圖1。實施例2 =UCMSCs對NOD小鼠的治療作用該實驗分為預防組及治療組。預防組選取4周齡雌性NOD小鼠20只，治療組選取 8周齡雌性NOD小鼠20只。各組內20只小鼠隨機分為2組。分別給予UC-MSCs及PBS。腹 腔注射1Χ 106/100ιι1細胞，共一次。每兩周進行唾液流量測定。至第16W結束觀察。留取 小鼠血清，頌下腺組織及脾細胞，ELISA檢測小鼠血清SS相關抗體，HE染色做頌下腺病理學 分析。結果顯示治療組及預防組NOD小鼠，UC-MSCs均能明顯增加其唾液流量；能明顯降低 NOD小鼠血清中抗體的表達；組織病理學顯示，UC-MSCs能明顯改善NOD小鼠頌下腺灶性淋
4巴細胞的浸潤。見圖2。實施例3 =UCMSCs對NOD小鼠MNCs的免疫調節功能(A)取UCMSCs治療組及PBS組MNCs，4 X IO5/孔接種于96孔板中，每孔均加 ConA (2 μ g/ml)刺激。120小時，3H摻入法檢測T細胞增殖情況。UCMSCs治療組的MNCs增 殖能力較PBS組明顯降低(B)同理，取UCMSCs治療組及PBS組MNCs，2X IO6/孔接種于 24孔板，48小時后，流式細胞術檢測小鼠脾細胞Treg的表達，UCMSCs治療組MNCs中Treg 的表達較PBS組明顯上調(C):在體外，將未干預的16周齡NOD小鼠MNCs(1X106/^L) 與UCMSCs (2 X IO4/孔)共培養，48小時后，流式細胞術檢測小鼠脾細胞Treg的表達，可見 UCMSCs能明顯上調Treg的表達。見圖3。實施例4 =UCMSCs對NOD小鼠細胞因子分泌的影響(A)實驗結束時，留取小鼠血清，ELISA檢測小鼠血清中細胞因子分泌，發現 UC-MSCs可下調NOD小鼠血清中IL-6的表達(B)取UCMSCs治療組及PBS組MNCs，2 X IO6/ 孔接種于24孔板，48小時后，收取細胞上清，檢測細胞因子，結果顯示UCMSCs治療組與PBS 組相比，MNCs細胞上清中IL-6表達下調，IL-10表達上調(C)在體外，將未干預的16周齡 NOD小鼠MNCs (1 X IO6/孔)與UCMSCs (2 X IO4/孔)共培養，48小時后，檢測細胞上清中細 胞因子，可見UCMSCs能明顯下調TNF-α、IFN-γ的表達，上調IL-10的表達。見圖4。實施例5 =UC-MSCs對SS患者T細胞的影響(A)分離SS患者外周血PBMC，磁珠分選⑶3+Τ細胞。分成兩組，一組為UCMSCs 與τ細胞共培養組，一組為單純T細胞對照組，兩組均加⑶3/⑶28 (5 μ g/ml)刺激。120小 時，3H摻入法檢測T細胞增殖情況。結果發現無論UCMSCs與T細胞是否接觸，共培養組T 細胞增殖受到明顯抑制，且呈劑量依賴性。(B)在UCMSCs與T細胞共培養體系中，加入抗 IL-10單抗(10 μ g/ml)，可逆轉UC-MSCs對T細胞增殖的抑制作用(C)將SS患者T細胞 (1X106/孔)與UCMSCs (2X IO4/孔)共培養，48小時后，檢測細胞上清中細胞因子，可見 UCMSCs可下調TNF- α的表達，上調IL-10的表達(D)將SS患者T細胞(1 X IO6/孔)與 UCMSCs (2 X IO4/孔)共培養，48小時后，流式細胞術檢測Treg的表達，UCMSCs能明顯上調 SS患者Treg的表達。見圖5。
權利要求
各種來源的間充質干細胞。
2.權利要求1的間充質干細胞在治療干燥綜合征中的用途。
3.權利要求1的間充質干細胞施用給干燥綜合征患者。
4.權利要求1的間充質干細胞在治療其它自身免疫病中的用途。
5.權利要求1的間充質干細胞施用給其它自身免疫病患者。
全文摘要
本發明證實間充質干細胞可用于干燥綜合征的治療。其特征在于抑制干燥綜合征的異常免疫反應，從根本上控制本病的發展。
文檔編號A61K35/44GK101974483SQ201010503679
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月12日 優先權日2010年10月12日
發明者何菁, 劉燕鷹, 栗占國 申請人:北京大學人民醫院