專利名稱：可生物降解的多聚納米微囊及其應用的制作方法
技術領域：
本發明與可改善體內循環時間的納米微囊組分及其應用和制備方法有關。本發明中的納米微囊組分適于包裹有治療意義的試劑，包括大分子物質。
背景技術：
紅細胞(RBC)中的血紅蛋白(Hb)是負責運輸氧氣的。當將血紅蛋白從紅細胞中抽提出來后，它可被消毒以除去HIV和其它感染源。不幸的是，當將抽提出來的血紅蛋白灌輸到人體時，它會在灌輸進入受體的血液循環系統后降解成二聚體。游離血紅蛋白尤其對腎有毒性。血紅蛋白分子可被化學修飾以避免灌輸后的降解。這些簡單修飾后的血紅蛋白已進入臨床試驗的最后一期。然而這種修飾的血紅蛋白沒有被膜覆蓋，因此它必須被超純化以避免引起不良反應。超純化也會除去紅細胞中那些所有對于防止氧化劑的有害效應而必需的酶。另外，修飾的血紅蛋白在人體內的循環半衰期相當短，大約24小時。
血紅蛋白只是機體需要的眾多重要的生物大分子中的一個例子。在疾病事件中，經常需要向機體提供大分子物質，這些大分子或者是因為疾病造成其缺失，或者被證明對疾病有治療功效。但在過去，以一種可接受的方式有效地傳輸這樣的大分子進入到機體中從而獲得所需要的治療效果是有困難的。
過去，人們已經嘗試微囊化血紅蛋白以應用于體內(Chang，T.M.S，1964，Science 146，524；Chang，T.M.S，1997，“Blood SubstitutesPrinciples，methods，products and clinicaltrial”，vol.I，Karser publisher，Basel。)火棉膠、纖維素、1，6-環己烷二胺(HMDA)，交聯蛋白、以雙層磷脂-膽固醇膜復合到交聯蛋白膜上形成的雙層膜以及其它一些物質已經被用于包裹血紅蛋白液滴(Chang，T.M.S，1997，“Blood SubstitutesPrinciples，methods，products and clinical trial”，vol.I，Karser publisher，Basel)。然而，這些直徑大約1微米的人造細胞經靜脈注射后，在宿主的循環系統中只能存活很短的一段時間。另外，這些人造細胞的多聚物膜會在體內積累。
然后人們的研究重點轉移到使用磷脂制備包含血紅蛋白的脂質體(Chang，T.M.S，1997，“Blood SubstitutesPrinciples，methods，products and clinical trial”，vol.I，Karserpublisher，Basel)。使用亞微米磷脂-膽固醇微囊(脂質體)可以延長血紅蛋白在體內循環時的存活時間(Djordjevich，L.et al.，1980，Exp.Hematol.8，584)。這些脂質體的缺點是缺乏穩定性和強度，而且磷脂膜對環境的降解具有敏感性。脂質體在儲藏或在宿主循環系統中會降解。另外，磷脂膜在原本清除循環系統中的細菌和毒素的細胞中會積累，結果造成機體抵抗感染和毒素的能力顯著降低。
隨后，包含血紅蛋白的可生物降解的多聚物膜發展起來了，這種技術在本專利所引文獻中由本發明者的一個專利號為5,670,173的美國專利中已予以表述。在這里，制備了一個直徑大約150納米的可生物降解的聚乳酸膜(T.M.S.Chang and W.P.Yu，美國專利5,670,173，公布于1997年9月23日)。聚乳酸在使用后可轉變成水和二氧化碳，因此，不會在體內積累。
如美國專利5,670,173號中所述，多聚物膜輸入受體后循環半衰期平均短于2小時。因此，出于實用的目的，如血液代用品，人們后來決定選擇使用具有較長循環半衰期的可生物降解多聚物膜。
相應的，人們高度希望獲得具有改善體內循環時間的多用途的可生物降解納米微囊。
同樣高度希望獲得具有至少6小時有效循環時間的可生物降解納米微囊。
進一步希望獲得具有至少14小時有效循環時間的可生物降解納米微囊。
進一步希望獲得具有至少24小時有效循環時間的可生物降解納米微囊。
還進一步希望獲得能對有治療意義的試劑選擇性通透的多用途的可生物降解納米微囊。
還希望獲得適合包囊有治療意義的試劑并在體內傳輸的多用途的可生物降解納米微囊。
更進一步希望獲得適合在體內傳輸被包裹的有治療意義的試劑并以可控制速度釋放的納米微囊組分。

發明內容
本發明提供了一種具有改善體內循環時間的多功能可生物降解納米微囊。本發明中的可生物降解納米微囊適合包裹有治療意義的試劑，并且適合在體內傳輸此試劑。本發明中的可生物降解納米微囊可以被應用于包裹多種有治療意義的試劑，包括，但不限于大分子物質，如血紅蛋白、酶、多肽、基因、聚合蛋白和聚合酶如聚血紅蛋白等。
更適宜的是，本發明中的可生物降解納米微囊適合多種被包裹的有治療意義的試劑，包括大分子物質，在進入受體體內后的可控制釋放。本發明中的納米微囊組分還適合包裹達到治療效果濃度的有治療意義的試劑，并傳輸此試劑進入受體體內循環系統。
另外，本發明中的納米微囊適于提供被包裹的有治療意義的試劑在體內進行可控制釋放。
依據本發明中一個實施例，提供了一種制備在體內循環半衰期至少35小時的納米微囊的方法。這種納米微囊已經顯示可傳輸一種范例大分子以可控制速率進入體內循環，該大分子循環半衰期達到至少14小時。
依據本專利的許多新方法被用來以使納米微囊組分適于以可控制速率在體內釋放包裹的大分子。例如，本發明中的一個納米微囊組分被改裝以適于將包裹的蛋白以半衰期2小時的逐步釋放方式改變成以半衰期至少24小時的速率釋放。相應地，本發明提供了一種可以改善體內循環時間的納米微囊組分，從而使包裹的有治療意義的試劑在體內循環中保留較長一段時間。這樣，本發明的納米微囊為體內傳輸和控制釋放多種以此法包裹的有治療意義的試劑提供了一種通用的載體。
本發明的一個目的是提供一種具有改善體內循環時間的多用途的可生物降解納米微囊。
本發明的另一個目的是提供一種具有至少35小時有效循環半衰期的可生物降解納米微囊膜。
本發明的另一個目的是提供一種具有至少6小時有效循環半衰期的可生物降解納米微囊組分。
本發明的另一個目的是提供一種具有至少14小時有效循環半衰期的可生物降解納米微囊組分。
本發明的另一個目的是提供一種具有至少24小時有效循環半衰期的可生物降解納米微囊組分。
本發明的另一個目的是提供一種可以選擇性地通透有治療意義的生物試劑的多用途的可生物降解納米微囊。
本發明的另一個目的是提供一種適于多種有治療意義的試劑體內可控制釋放或傳輸的多用途的可生物降解納米微囊組分。
本發明進一步的目的是提供一種制備具有改善體內循環時間的納米微囊組分的方法。
本發明更進一步的目的是提供一種體內傳輸有治療意義的試劑的方法。
本發明提供了一種適合包裹有治療意義的試劑并增強體內循環時間的可生物降解的多聚納米微囊膜組分，所述的納米微囊膜組分由聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的共聚物組成，此共聚物溶于丙酮，不溶于水。
本發明另一方面提供了一種血紅蛋白納米微囊組分，所述的組分是由包裹具有有效治療濃度的血紅蛋白制劑的一種可生物降解的多聚納米微囊膜組成；所述的納米微囊膜包含聚乳酸和聚乙二醇的共聚物；所述的共聚物溶于丙酮，不溶于水；其中所述的納米微囊組分適于增強所述的血紅蛋白制劑的體內循環時間。
本發明中的血紅蛋白納米微囊組分可以包括其它一些已知的抑制高鐵血紅蛋白生成的生物試劑。而且，本發明中血紅蛋白納米微囊組分可以被調整成選擇性地通透體內循環中存在的一些分子，從而阻止納米微囊內的血紅蛋白轉變成高鐵血紅蛋白。
本發明的另一方面進一步提供了一種制備具有延長體內循環時間的納米微囊組分的方法。所述的方法包括(a)制備聚乳酸和聚乙二醇的共聚物混合物(PLA-PEG)；(b)加熱所述的共聚物混合物；(c)加入包含有治療意義的試劑的水溶液到所述的共聚物混合物中；(d)從所述的水溶液中沉淀出所述的共聚物混合物；和(e)從那里提取納米微囊組分；這里所述的組分包括包裹了所述的有治療意義的試劑的可生物降解的多聚納米微囊膜。
本發明中制備具有延長體內循環時間的納米微囊組分的方法可以進一步包括，將有治療意義的試劑在和聚乳酸-聚乙二醇共聚物混合物混合之前先與一交聯成分孵育。作為選擇和另外，本分明中制備納米微囊組分的方法可以進一步包括至少交聯一部份包裹的有治療意義的試劑到納米微囊的內表面上，其中交聯成分是在聚乳酸-聚乙二醇共聚物混合物和有治療意義的試劑混合后加入的。
本發明中的交聯成分可以是戊二醛。但是，業內人士都知道別的交聯成份也是可以被應用的。
本發明的另外一個方面提供了一種可以延長有治療意義試劑體內循環時間的傳輸系統。所述的系統包括一種可生物降解的多聚納米微囊組分，該組分由包裹有所述的有治療意義的試劑的共聚物膜組成；此處所述的共聚物膜包括一種聚乳酸和聚乙二醇的共聚物；這種共聚物溶于丙酮不溶于水；所述的共聚物膜適應于傳輸已包囊的有治療意義的試劑以可控速率釋放進入體內循環。
本發明還更進一步提供了一套以逐級方式釋放有治療意義試劑的傳輸系統，所述的系統包括多種可生物降解多聚納米微囊組分，其中每一種微囊組分適應于以預先確定的不同速率在體內釋放包裹的所述的有治療意義的試劑；此處所述的每一種微囊組分包括一種由聚乳酸與聚乙二醇共聚物組成的共聚物膜，共聚物溶于丙酮不溶于水。
此外，本發明中的載藥系統也可適應于選擇性地通透存在于受藥者體內循環系統的生物成分。本發明的具體實施例說明，所包囊的有治療意義的試劑的質量和完整性也能夠得以保持。
除此之外，本發明的載藥系統也可能適應于把有治療意義的試劑與別的生物成分包裹在一起。按照本發明的另外一個具體實施例，載藥系統改進的體內穩定性是通過部份包囊的藥或有治療意義的試劑交鏈到納米微囊內表面所提供。
本發明也提供了一種包含可生物降解多聚納米微囊膜的納米微囊組分，該膜包囊了一種具有有效治療濃度的大分子；所述的納米微囊膜包含一種由聚乳酸與聚乙二醇組成的共聚物；所述的共聚物溶于丙酮不溶于水；此處所述的納米微囊組分適應于提高所述的大分子的體內循環時間。
下文定義了本發明所用的一些術語。
術語“治療性試劑”是指當體內給藥時有治療潛力的任何試劑，包括，但不僅限于大分子物質，例如血紅蛋白、蛋白質、酶、核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)和基因。


圖1以圖形的方式示出按照本發明所得的多種納米微囊組分的循環時間。
圖2以圖形的方式示出包囊于按照本發明所得的多種納米微囊組分中的Hb的保留時間。
圖3A和圖3B示出按照本發明所得的多種納米微囊組分的循環時間。
圖4示出按照本發明所得的多種納米微囊組分的循環時間。
圖5以圖形的方式示出非紅細胞的血紅蛋白(g/dl)歷時濃度。
具體實施例方式
本發明提供了增加體內循環時間的改進型的可生物降解的納米微囊。更為可取的是，本發明的可生物降解的納米微囊是多聚納米微囊。本發明的可生物降解的納米微囊適合于包囊有治療意義的試劑并將其輸入于受者體內循環。此外，本發明的納米微囊組分適合于延長所包囊的試劑的體內循環時間。對于實際的治療應用，例如血液代用品，納米微囊組分的體內循環半衰期多于14小時為佳。因而，人們開展了與本發明相關的廣泛研究和開發以設計一種具有增加體內循環時間的納米微囊組分。此處說明了一個新型的策略，以血紅蛋白為例但不僅限于血紅蛋白，以提供一種具有延長體內循環時間并且/或者具有體內可控釋放速率的血紅蛋白納米微囊組分。
本發明提供了一種新型的納米微囊組分，可適于包囊和有效地運載有治療意義的試劑。例如，與血紅蛋白一起，納米微囊組分可被用作血液代用品。通過增加所包囊試劑的體內循環時間，本發明的納米微囊組分可以顯著地增加包囊試劑在體內發揮功能的持續時間，因而增加了該成分的治療效果。此外，本發明的納米微囊組分可以有效地以可控方式輸送給定劑量的有治療意義的試劑，從而提高了劑量的效果同時總起來也減少了給藥次數。
按照本專利所側重的方面，具有治療效果數量的血紅蛋白被包囊于一個納米微囊組分并適宜于輸送至受者體內循環，在體內循環中給藥。被包囊的血紅蛋白發揮血液代用品的功能在體內運載氧氣。而且，當包囊的血紅蛋白從納米微囊膜釋放出來后，它繼續起到運輸氧氣的功能，這樣就增加了包囊的血紅蛋白在體內的作用總長度。
本發明進一步提供了一種新型的載藥系統用來可控制地釋放有治療意義的試劑到體內循環。這種通過修改或調整本發明的納米微囊組分從而達到以可控速率釋放被包裹試劑的可行性，提供了一種新型治療性的載藥系統。而且，本發明的多種納米微囊組分可一起聯用以提供一種有效的逐級治療性的載藥系統。按照本發明的這一方面，每一納米微囊組分適合于以預定的釋放速率傳輸所包囊的有治療意義的試劑。當多種納米微囊組分同時輸入體內時，因每一種具有其預定的釋放速率，這樣被包囊的有治療意義的試劑在體內則會以逐步方式釋放。
按照本發明的一個實施例，可生物降解的多聚納米微囊提供的體內循環半衰期至少為35小時，這一點下文要進行討論。本發明的納米微囊組分適合于包囊各種不同的治療試劑，包括大分子物質，例如血紅蛋白、酶、RNA、DNA和包括非常大的聚血紅蛋白和酶在內的其它蛋白質，并且在體內以可控的速率釋放這些治療試劑，因而提高了被包囊試劑的體內循環時間。本發明的納米微囊組分更進一步地作為具有有效治療濃度的治療試劑的載體，提供體內控制釋放。按照本發明，有治療意義的試劑可以是但不限于大分子物質。
按照本發明的一個實施例，納米微囊可維持其體內半衰期在35小時，我們能夠改變包裹的蛋白的釋放速率在大鼠中，從釋放速率半衰期2小時逐級改變到釋放速率半衰期至少24小時。正如下文繼續討論的，據信本發明獲得的納米微囊組分在人體內的半衰期將會更長。這樣，本發明就提供了一種可在體內控制釋放各種有治療意義的試劑的多用途載藥系統。
舉例來說，一個有治療意義的試劑可以被本發明的一種納米微囊組分包囊并通過任何一種納米微囊傳輸方法引入受者體內循環。例如，本發明的納米微囊組分可以通過，但不僅限于，靜脈內、肌肉內、腹膜內、或皮下傳輸，也可通過口腔或者皮膚吸收途徑給藥。納米微囊組分可以經修飾以使被包囊的試劑以可控速率從納米微囊載體釋放。結果，有用的試劑被引入體內循環，以可控速率釋藥來達到所希望的治療效果。如下文的示例，本發明納米微囊組分的釋放速率通過多種方式，使被包囊的治療性試劑達到期望的釋放速率。
按照本發明的例子說明，把血紅蛋白包裹在納米微囊載體中，這樣在體內獲得足夠長的循環時間而達到治療效果是可能的。因而，可以充分預期，本發明的納米微囊組分事實上可以用來包囊包括具有有效治療濃度的任何有治療意義的試劑，其中包括大分子，來提供一個藥物控釋傳輸系統。
按照本發明，制備納米微囊組分的方法應包括，但不僅限于此，改變納米微囊膜的通透性；降低納米微囊膜的降解速率；或增加被包囊的有治療意義的試劑的分子大小來適應納米微囊組分從而維持一個期望的循環半衰期和/或控釋速率。
材料與方法材料聚乳酸聚乳酸(PLA)從Polysciences Inc.(加拿大)獲得。異丁基-2-氰基丙烯酸鹽(IBCA)，表面活性劑(Tween 20TM，Span 85TM，Triton X100TM，和Pluronic F68TM)，乙烷基纖維素和L-α-卵磷脂(氫化的)及其它磷脂，例如二甾酰卵磷脂(DSPC)或DSPG和醋酸生育酚從Sigma化學公司(USA)獲得。透析膜(Spectrapor 5TM)從Fisher科學公司購買。二乙醚、乙酰乙酸、環己烷和氯仿從BDH化學公司(加拿大)購買。所有其它化學藥品，例如，甲氧基聚乙二醇(分子量2000，分子量3350)和2-乙基己酸亞錫，均是試劑級。
方法制備血紅蛋白溶液無基質血紅蛋白(Hb)根據標準方法制備(Chang，T.M.S，1997，“Blood SubstitutesPrinciples，methods，products and clinical trial”，vol.I，Karser publisher，Basel)。簡單地說，無基質血紅蛋白是通過低滲溶牛血細胞，并通過甲苯抽提、高速離心凈化來制得。最終溶液含有10-15g Hb/dl。為了減少高鐵血紅蛋白的形成，操作過程在4℃下進行，血紅蛋白溶液的pH值控制在7.4。
制備可生物降解的多聚納米微囊組分(標準方法)有機相溶解100mg(d.l)-聚乳酸(分子量為25000)(購自Polysciences，Warrington，PA)在8毫升(ml)的丙酮中。在超聲波水浴器(非常低的能量)中溶解50毫克(mg)氫化的大豆卵磷脂(購自Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)于4毫升乙醇中。上述兩溶液混合后(加入任何一種至另一種)，用做有機相。
水相取0.04毫升Tween 20與25毫升的15％(g/dl)的血紅蛋白溶液相混合。
制備在磁力攪拌下[用Thermo-Swirl攪拌器(制造商為Precision Scientific Co.，Chicago)，設置于6檔]，于4℃下將有機相緩慢(8毫升/分鐘)注入水相。注射頭用0.2毫升的移液管頭制得。納米微囊立刻形成，但是，繼續維持攪拌懸浮液15分鐘。所得的懸浮液為37毫升。在20℃和真空下通過旋轉蒸發儀從上述懸浮液中除去部份有機溶劑，用時大約10分鐘。這樣就獲得了33毫升的懸浮液(即除去4毫升有機溶劑)。剩余的懸浮液與15毫升的0.9％NaCl相混合。然后，有機溶劑和游離的血紅蛋白通過超濾除去(用AmiconZM 500,000膜，分子量截留值為500,000)。懸浮液用0.9％NaCl通過超濾重復洗凈。整個操作在4℃和氮氣保護下完成。
按照上述標準程序制備的納米微囊膜組分，經過按下文所述修改，用來提供具有改進循環時間和控制釋放速率的本發明所述的納米微囊組分。
以下文例子為證，例II列出了制備具有循環半衰期35小時的納米微囊的方法。在該例中，盡管納米微囊本身的循環時間半衰期為35小時，但所包裹物被發現會從納米微囊漏出，其半衰期為2小時或更短。例III以對例II中膜特性修飾為示例，這種修飾后的納米微囊可以保持被包囊的試劑存活更長時間。例IV示例了更進一步的修飾導致改進了被包囊試劑的保留時間。例IV結合了下述兩種修飾方法(1)例II和例III中納米微囊膜的修飾方法；(2)對被包裹的試劑本身的修飾，例如以不同的聚合度交聯大分子以在包裹之前提供較大的分子質量。每一個范例中都描述了修飾的細節。例II到IV中每一個范例都有許多不同的修飾方法和策略。
參考下列給定的范例來說明但不是限制它的范圍將會更容易理解本發明。
例I標準多聚納米微囊的制備我們首先改變五種多聚納米微囊的膜組成，研究它們對循環時間的作用。
(1)聚乳酸(PLA)納米微囊由上文提到的制備標準納米微囊的方法制得。這些聚乳酸納米微囊顯示了大約2個小時的循環半衰期(見圖1)。
(2)把磷脂加入由標準方法制備的納米微囊聚合膜中僅會引起循環時間的輕微增加(此項在圖1沒有顯示)。在這里，氫化大豆卵磷脂(HSPC)和二硬脂酰卵磷脂(DSPC)被引入到了聚乳酸納米微囊中。
(3)把磷脂-聚乙二醇(PEG)引入到納米微囊的多聚膜中并沒有使體內循環時間明顯增加(見圖1-PLA+PEG-脂質曲線)。這里，1，2二硬脂酰甘油-3-磷酸二乙胺-N-聚乙二醇2000被引入到聚乳酸納米微囊膜中。
(4)本發明也研究了納米微囊對聚乙二醇的吸收。7％的聚乙二醇(分子量15000)被加入到聚乳酸納米微囊中，置于混懸液中6小時。不幸的是，這樣在循環時間上并沒有引起明顯增加(見圖1-聚乙二醇吸附到聚乳酸上的曲線)。
(5)混合10克甲氧基聚乙二醇(分子量2000)和10克DL-乳酸，并在160℃和氮氣保護下攪拌，制得標準聚乳酸-聚乙二醇共聚物。然后加入50微升的2-乙基己酸亞錫，在160℃下恒溫下保持3小時。然而，該聚合物溶于水，因此不能用于血紅蛋白聚乳酸納米微囊中。這種組成被認為不適用封裝水溶性大分子到納米微囊中。
例II包裹血紅蛋白的納米微囊組分的制備(1)有機相溶解100毫克如下文制備而得(見方法2)的聚乳酸-聚乙二醇共聚物到8毫升丙酮中。在超聲水浴(非常低的能量)中溶解50毫克氫化大豆卵磷脂(購自Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)到4毫升乙醇中。上述兩種溶液混合，作為有機相使用。
(2)水相取0.04毫升TWEEN 20，與25ml 15％(g/dl)血紅蛋白溶液混合。
(3)制備4℃時，在磁力攪拌下〔Thermo-Swirl攪拌器(制造商為Precisoin ScientificCo.，Chicago)，設定在6檔〕，緩慢注射(8毫升/分鐘)有機相到水相中(注射頭由0.2ml移液管頭制成)。納米微囊立即形成，但是，繼續攪拌懸浮液15分鐘。制備的懸浮液為37毫升。
用旋轉蒸發儀在20℃下經大約10分鐘脫除上述懸浮液中的部份有機溶劑。獲得的懸浮液為33毫升(也就是說，脫除了4毫升有機溶劑)。剩下的懸浮液與15毫升0.9％NaCl混合。然后有機溶劑和游離的血紅蛋白用超濾裝置除去(用Amicon ZM 500,000膜，分子量截留在500,000)。懸浮液通過超濾反復用0.9％NaCl溶液沖洗。
操作在4℃和氮氣保護下進行。
隨后確定了一個適宜的納米微囊聚合物應溶于丙酮而不溶于水。我們對下面的新共聚物經過了研究，希望能用于本發明中的納米微囊的制備方法1-1克D，L-聚乳酸(分子量10,000)和0.5克聚乙二醇(分子量3350)在真空中干燥過夜，加入5毫升丙酮，在氮氣保護下將混合物加熱到100℃等待1小時。加入20微升的2-乙基己酸亞錫后，混合物在氮氣保護下升溫到180℃等待6小時。最終的聚合物溶于丙酮。這種共聚物隨后與血紅蛋白一起以上文所述方法用來制備可降解納米微囊組分。然而，這種聚乳酸-聚乙二醇共聚物的制備(PEG-PLA方法1)并沒有足夠地增加循環半衰期(見圖1)。
方法2-1.5克DL-聚乳酸(分子量10,000)和0.75克甲氧基聚乙二醇(分子量2000)在真空中干燥過夜。在氮氣保護下加溫到180℃保持2小時。在加入10微升的2-乙基己酸亞錫之后，混合物在氮氣保護下加溫到180℃保持3小時。最終的聚合物溶于丙酮。如上文所述，這種共聚物隨后與血紅蛋白一起以上文所述方法用來制備可降解納米微囊組分。我們將該制品(PLA-PEG方法2)用于大鼠，測得循環半衰期大約35小時(見圖1)。因此，這種聚乳酸-聚乙二醇共聚物可以作為新的改進型可生物降解多聚納米微囊的候選物。
方法3-我們進行了另一項研究以測定使用更高分子量的聚乙二醇是否能進一步增加循環時間。將2克DL-聚乳酸(分子量10,000)和1克聚乙二醇(分子量3350)在真空中干燥過夜，加入5毫升丙酮，混合物在氮氣保護下加溫到100℃保持1小時。然后，混合物在氮氣保護下加溫到180℃保持10小時。此共聚物溶于丙酮。此共聚物隨后與血紅蛋白一起按上文所述方法用來制備可生物降解納米微囊組分，這種制備并沒有足夠地增加循環半衰期(圖1)。
例III采用PLA-PEG共聚物作為納米微囊載體當我們獲得具有充分循環半衰期的納米微囊后，我們隨后以血紅蛋白這個大分子為例來研究這種納米微囊制品。根據上述我們獲得的具有35小時循環半衰期的聚乳酸-聚乙二醇共聚物制品(方法2)，我們進一步研究了這一制品用作在體內傳輸血紅蛋白的納米微囊膜載體。根據本發明，血紅蛋白作為大分子的一個例子用來表明本發明中納米微囊可作為有治療意義試劑的載體的特性。然而，本發明并不僅限于血紅蛋白。
我們成功得制備了血紅蛋白納米微囊(如上文所述)。
這些納米微囊顯示了大約35小時的循環半衰期，類似于那些不含血紅蛋白的納米微囊。然而，微囊化的血紅蛋白在注入體內循環后有滲漏的跡象，并且滲漏后很快消失。在納米微囊載體中的血紅蛋白組分的循環半衰期小于2小時，然而，納米微囊本身繼續循環，半衰期為35小時，納米微囊的膜慢慢地降解和變得泄漏。
如表1所示，我們采用了各種方法解決本發明中大分子組分從納米微囊中滲漏的問題。血紅蛋白納米微囊是用已詳細敘述的制備聚乳酸-聚乙二醇納米微囊的方法制備而得。隨后，得到的血紅蛋白納米微囊用戊二醛進行交聯。這樣做的目的是在納米微囊內部交聯血紅蛋白以產生更大分子，比如聚血紅蛋白，從而降低它們從納米微囊中釋放的速率。另外，血紅蛋白分子在納米微囊內表面附近交聯，這樣就降低了納米微囊膜的滲透性。表1以血紅蛋白為例，顯示了為變化本發明中納米微囊組分釋放速率所采用的多種途徑，包括改變(1)以交聯基團與血紅蛋白之比所表示的戊二醛的量；(2)以交聯時間表示的交聯過程的持續程度和(3)所使用的戊二醛的濃度。所得到的血紅蛋白聚乳酸-聚乙二醇納米微囊的循環半衰期如T1/2列所示。
表1用于增加血紅蛋白在聚乳酸-聚乙二醇納米微囊內保留時間的實驗步驟


當提高交聯時間到5小時，交聯試劑的濃度到0.5M時，血紅蛋白聚乳酸-聚乙二醇納米微囊的循環半衰期就增加到16小時(見圖2)。與未交聯的血紅蛋白納米微囊的循環時間為2小時相比，這是一個重大的改進。這比交聯血紅蛋白溶液在大鼠體內循環時間8到12小時要長。更進一步，因為在大鼠體內的循環半衰期一般要比在人體內短很多，這個結果提示以本發明所使用的納米微囊組分可在人體內顯著提高循環半衰期。然而，我們將繼續設計新的途經來降低血紅蛋白注入體內后從納米微囊中釋放的速率。
血紅蛋白納米微囊的交聯步驟為了強化納米微囊膜，我們采用包括交聯在內的不同方法。下面所列表2顯示了不同方法的研究概述，并在圖3A和3B中得到了表明。
表2總結了更進一步研究納米微囊強度的實驗，這些研究運用了表1中所提及的交聯聚乳酸-聚乙二醇血紅蛋白微囊的方法。如表2所示，“Xlink”指表1中戊二醛和血紅蛋白的比例；“PLA-PEG”是指制備聚乳酸-聚乙二醇血紅蛋白納米微囊中聚乳酸/聚乙二醇的分子量；“交聯時間”指與交聯劑的交聯反應時間；“分離”指如前所述的制備聚乳酸-聚乙二醇血紅蛋白納米微囊的詳細方法中濃縮納米微囊的步驟；“乙醇”指制備過程中使用乙醇的情況。表2的第一列提供了列2到6的結果總結。比如15KX(12∶1)0.25F是指聚乳酸的分子量為15Kd(戊二醛與血紅蛋白比率為12∶1)，反應時間為0.25小時，通過過濾分離。
表2


血紅蛋白納米微囊的循環時間200克大鼠的全血量大約為12毫升。30％的最高負荷量是注入大鼠占總血量30％的納米微囊混懸液，也就是3.5毫升。30％的最高負荷量的結果顯示在圖3A和3B中。圖3A和圖3B顯示了用表2的方法所得到的循環時間，這些循環時間的最好結果是當所用納米微囊組分中的聚乳酸的分子量范圍在5K-15K區間時取得的。
如圖3A和3B所示，在最初的6個小時，血紅蛋白納米微囊循環得很好。然而，當注入后24小時后取樣分析，血紅蛋白納米微囊只剩下15％-25％。納米微囊組分的半衰期從原來的小于2小時(見5K曲線)提高到大約14-16小時。
生物降解能力使用透析膠吸收方法可將游離的血紅蛋白和游離的交聯血紅蛋白與聚乳酸-聚乙二醇血紅蛋白納米微囊分離開來。當把注入體內2小時后的血紅蛋白納米微囊樣品置于這個裝置中，沒有游離的血紅蛋白被分離出來，表明血紅蛋白納米微囊保持完整狀態。當在透析管中把血紅蛋白納米微囊混于血漿，在6小時后沒有游離的血紅蛋白被提取出來。在這之后，游離的血紅蛋白慢慢地出現于懸置液中，被凝膠所萃取，顯示在血漿中六小時后由于生物降解，聚乳酸膜的完整性開始緩慢得到破壞。
聚合物組成鑒于聚乳酸的分子量越大，生物降解越緩慢，分子量為15-25K的聚乳酸被用來制備聚乙二醇-聚乳酸共聚物。使用更高分子量的聚乳酸要求加熱到200℃來完成聚乙二醇-聚乳酸共聚反應，這樣有可能導致聚乳酸分子的分解。以聚苯乙烯為標準的體積排阻色譜，Mn＝6900，Mw＝8600，Mz＝7000，Mw/Mn＝1.24顯示聚乳酸-聚乙二醇共聚物的分子量減少到只有6900。于是，我們觀察到了聚乳酸分子的大幅度分解。
從分子量15000到25000的聚乳酸得到的結果在圖4A及4B中列舉了出來。除了下面要討論的15K聚血紅蛋白的個例(見15K聚血紅蛋白曲線)，我們沒有觀察到循環周期的延長。
例IV帶有聚血紅蛋白的聚乳酸-聚乙二醇共聚納米微囊的應用聚血紅蛋白是以血紅蛋白分子聚合形成的尺寸較大的大分子。最好每個聚血紅蛋白是由4至5個血紅蛋白分子通過化學鍵連接在一起。
我們已經表明聚乙二醇-聚乳酸納米微囊(空的或裝有血紅蛋白的)的循環半衰期為35個小時。然而，由于隨著時間流逝微囊內部血紅蛋白的泄漏，在血紅蛋白納米微囊中的血紅蛋白的循環半衰期會相對較短些。因此，我們研究了包裹分子量大約在240000到360000之間的聚血紅蛋白的應用前途。與較小的分子量大約64000的內源血紅蛋白相比，這樣會面臨較少的泄漏問題。正如圖4A和4B中15K聚血紅蛋白曲線所示，這樣明顯地把循環半衰期從原來的1-2小時延長到了14個小時。因此，本發明提供了延長包裹有治療意義試劑的納米微囊組分體內循環時間的方法。比如，一個大分子能夠交聯以形成更大的分子并隨后被本發明所述的一種納米微囊組分所包裹。此外，其它有意義的大分子也可與血紅蛋白混合以形成聚血紅蛋白復合物。
根據本發明，交聯有治療意義的試劑可以在封入微囊前或后進行。另外，被包裹的試劑也可以被交聯到納米微囊膜的內表面上。
(1)含有較少單體血紅蛋白分子的聚血紅蛋白的應用我們研究了膜組分的變化以改進納米微囊的循環時間以及改善在循環中納米微囊內血紅蛋白的保留情況。結果，我們把注意力集中到制備注入體內后能夠保持一定血紅蛋白水平以攜氧的納米微囊上。這是通過前面方法所述降低納米微囊的生物降解性，改變微囊的滲透性，比如用交聯試劑交聯某些被包裹試劑到納米微囊膜上和/或使用較大分子用以被納米微囊所包裹來改進血紅蛋白納米微囊的。結果，本發明的納米微囊組分適于提供(1)被包裹試劑在體內的更高起始濃度，以及(2)延長被包裹試劑的循環時間。
在前面的研究中，我們分析了血紅蛋白濃度的消逝曲線的斜率并外推至零點以計算循環半衰期。這種方法可用于比較和篩選用不同配方制成的大量不同種血紅蛋白納米微囊。但是，這種分析方法更適于觀察載藥系統的釋放速度。按照本發明的其中一個方面，我們研究了在循環中供氧的血紅蛋白的實際量。相應地測定了在循環中存留的血紅蛋白的實際量而不是曲線的斜率。
運用60毫升/千克作為大鼠的血液容量，并已知輸入的血紅蛋白納米微囊的量，就可以算出每次輸入后血紅蛋白的可能最高量。然后，就可跟蹤血紅蛋白在循環中的濃度。我們知道血紅蛋白血漿代用品在大鼠體內的循環半衰期要比在人體內短很多。因此，我們做出了把在大鼠身上的實驗結果的重要性推廣到人時所需的基線標準。我們同時還進行了由戊二醛交聯的聚血紅蛋白的研究。已知這些聚血紅蛋白在人體內的循環半衰期是大約24小時，我們獲得了外推到人的直接理論基礎。但是，我們知道大鼠具有較為活躍的網狀皮內細胞系統(RES)，用于除去像納米微囊這樣的微粒。因此，當將血紅蛋白納米微囊外推到人時，循環半衰期會比實際在老鼠體內的時間還要長得多。
(2)應用聚血紅蛋白的基線研究為了得到有效的對比，所有用大鼠的研究實驗方案相同。聚血紅蛋白和血紅蛋白納米微囊懸浮液都調整到具有相同的10g/dl的血紅蛋白濃度。聚血紅蛋白和血紅蛋白納米微囊的輸入體積相同，并且都是總血量的30％(即30％的最高負荷量)。
表3表明在大鼠體內使用30％最高負荷量的聚血紅蛋白制品(血紅蛋白含量為10g/dl)的結果是最大非紅細胞血紅蛋白濃度為3.35g/dl，在14小時內降低到1.67g/dl，為其最高濃度的一半〔見聚血紅蛋白(17∶1)〕。從這里開始，聚血紅蛋白(17∶1)作為基線與其它血紅蛋白的制品進行比較，包括比較不同方法制備的非紅細胞血紅蛋白循環達到濃度1.67g/dl所用的時間。因此，在聚血紅蛋白(10∶1)的例子里，最高非紅細胞血紅蛋白濃度是3.10g/dl，在10.4小時內降低到了1.67g/dl。
使用30％最高負荷量的包裹血紅蛋白(10∶1)的結果是最高非紅細胞血紅蛋白水平只有3.05g/dl(標準誤差為0.03)(見表3)。這里的血紅蛋白先通過戊二醛交聯，所用戊二醛與血紅蛋白的比例為10∶1，然后再由聚乳酸-聚乙二醇納米微囊包裹。非紅細胞血紅蛋白濃度在大鼠內經過12.3小時降低到1.67g/dl(等同于人體內21小時)。
基于體重、血液體積、血漿體積以及稀釋系數的計算表明血紅蛋白納米微囊的最高非紅細胞血紅蛋白濃度至少是3.6g/dl，而不是在表3中包裹血紅蛋白(10∶1)的3.05g/dl。這似乎表明輸入的血紅蛋白納米微囊的相當一部分(大約16％)在幾乎剛輸入后就被除去了。因此，下一步工作是要嘗試避免這種情況。
在以上的制備中，血紅蛋白在被包入納米微囊前首先交聯成聚血紅蛋白。
聚血紅蛋白較大的分子尺寸會延遲血紅蛋白在循環過程中因為納米微囊膜的降解而泄漏，從而延長其循環半衰期(見表3)。以聚血紅蛋白(10∶1)為基礎，我們更詳細地分析了上述聚血紅蛋白制品中的聚血紅蛋白的分子質量分布。隨后，如下文例子所述，我們提高了聚合程度來明顯降低單四聚體血紅蛋白的量(見聚血紅蛋白17∶1)，然后再進行包裹。
(i)“包裹血紅蛋白(17∶1)”配方在下面關于血紅蛋白納米微囊的配方中，我們用到了聚血紅蛋白“包裹血紅蛋白(17∶1)”。在此配方中，交聯試劑(戊二醛)與血紅蛋白的比例在交聯反應以形成聚血紅蛋白過程中為17∶1。100毫克聚乳酸-聚乙二醇共聚物和50毫克磷脂溶解于3毫升乙醇和6毫升丙酮的混合溶液中。然后，該溶液在連續磁力攪拌下被緩慢注入到25毫升上述含有0.24％的Tween20的聚血紅蛋白溶液中。乙醇和丙酮擴散入水相就形成微粒。在4℃下通過在鹽溶液中的透析，就能容易地除去水相中的乙醇和丙酮。
表3


正如表3中所示，灌輸2分鐘后，最高非紅細胞血紅蛋白濃度是3.58g/dl(標準誤差為0.04)。這明顯高于前面所講的血紅蛋白納米微囊[包裹血紅蛋白(10∶1)]的3.05g/dl(標準誤差為0.04)。這也接近非紅細胞血紅蛋白濃度的最高可能起始值。此外，消逝曲線的斜率也更慢，但更重要的是與早前血紅蛋白納米微囊(包裹血紅蛋白(10∶1)在大鼠和人體內分別是12.3和21.1小時相比，非紅細胞血紅蛋白水平在老鼠和人體內分別用了17.1和29.3小時才降低到1.67g/dl。這個非常明顯的增長通過逐步改變配方的方式更進一步得到提高，直到達到最大濃度3.66g/dl(標準誤差為0.03)，以及通過24.2小時(大鼠)或41.5小時(人)后才降到1.67g/dl(例如，從包裹血紅蛋白1.5 Conc.(5k)到包裹血紅蛋白1.5 Conc.(15k)XL)。
(ii)“1.5 Conc(5k)”配方“1.5 Conc(5k)”配方是由與上面“包裹血紅蛋白(17∶1)”配方相似的方法制備的，只是聚乳酸-聚乙二醇共聚物的濃度提高到1.5，以得到一個更厚的納米微囊膜，使其生物降解較慢，從而能夠具有較長的循環時間。其結果是循環時間得到了進一步延長。輸入樣品2分鐘后，非紅細胞血紅蛋白的最大值達到3.60g/dl(標準誤差為0.01)，而較早的血紅蛋白納米微囊只有3.05g/dl(標準誤差為0.04)(見表3)。消逝曲線的斜率情況也變得更慢，但更重要的是非紅細胞血紅蛋白水平在老鼠與人的體內分別經過20.0和34.3小時降低到1.67g/dl的水平(見圖5)。
(iii)“2.0 Conc(5k)”配方“2.0 Conc(5k)”配方是在上述“1.5 Conc(5k)”配方的基礎上，提高了聚合物的濃度用以更進一步改進納米微囊膜穩定性。然而，這種方式形成的血紅蛋白納米微囊存在聚集成團的傾向，因此沒有被選中用于動物試驗。
(iv)“1.0 Conc(5k)(XL-Ecap，XL4)”配方在血紅蛋白納米微囊懸浮液形成后向其中加入戊二醛來修飾“包裹血紅蛋白(17∶1)”配方，這樣就形成了“1.0 Conc(5k)(XL-Ecap，XL14)”配方。這種配方中通過交聯任何血紅蛋白納米微囊表面血紅蛋白以進一步改進膜的穩定性。如表3中所示的血紅蛋白納米微囊“包裹血紅蛋白(17∶1)”經過如下的進一步處理。把交聯劑戊二醛加入到血紅蛋白納米微囊懸浮液，這就交聯了任何靠近納米微囊表面的血紅蛋白以進一步增強納米微囊膜的穩定性。24小時后向其中加入2M的賴氨酸(賴氨酸/血紅蛋白摩爾比為100∶1)來中止血紅蛋白的聚合。這種方法與“1.5 Conc(5k)”配方中使用1.5倍濃度聚合物延長循環時間的程度相同。這樣，在輸入2分鐘后，最高非紅細胞血紅蛋白濃度同樣有很明顯地提高為3.60g/dl(標準誤差為0.01)，而前面所述的血紅蛋白納米微囊時的濃度3.05g/dl(標準誤差為0.04)(見表3)。消逝曲線的斜率也非常緩慢，但是更重要的是非紅細胞血紅蛋白水平在老鼠和人體內分別經歷20.3和34.8小時才降到1.67g/dl(見表3和圖5)。
(v)“1.0 Conc(15k)”配方我們同樣研究了通過提高聚乳酸分子量來改善血紅蛋白納米微囊膜穩定性的可能。為此，我們用15k聚乳酸替代了“包裹血紅蛋白(17∶1)”配方中的5k聚乳酸。結果與“包裹血紅蛋白(17∶1)”配方相比，我們觀察到循環半衰期明顯的延長。因此，輸入2分鐘后，與早前血紅蛋白納米微囊的3.05g/dl(標準誤差為0.04)相比，這里非紅細胞血紅蛋白的最高濃度是3.57g/dl(標準誤差為0.05)。消逝曲線的斜率也變得很慢，但更重要的是非紅細胞血紅蛋白水平在老鼠和人體內分別經過21.2和36.6小時才降低到1.67g/dl的水平(見表3，圖5)。
(vi)“1.5 Conc(15k)”配方我們緊接著既使用較高分子量的聚乳酸(15K)也提高了聚合物的濃度(提高到1.5倍)。這是通過使用上面所述“1.0 Conc.(15k)”配方，所不同的是使用1.5倍的聚合物濃度。這種配方結合了下述三個方面(1)使用含單個四聚體血紅蛋白量低的特制的聚血紅蛋白(2)使用1.5倍濃度的聚乳酸-聚乙二醇共聚合物以及(3)使用了大分子量的聚乳酸(15k)。
這樣就更進一步地明顯延長了循環周期。在輸入2分鐘后，與前面血紅蛋白納米微囊的3.05g/dl(標準誤差為0.04)相比，非紅細胞血紅蛋白的最高濃度是3.6458g/dl(標準誤差為0.02)。消逝曲線的斜率也變得很慢，但更重要的是非紅細胞血紅蛋白水平在老鼠和人體內分別經過23.3和39.9小時才降低到1.67g/dl的水平(見表3，圖5)。
(vii)“1.5 Conc(15k)(XL-Ecap，XL4)”配方最終，我們結合了所有上述可以增加循環時間的方法(1)利用含單四聚體血紅蛋白量低的特制聚血紅蛋白；(2)利用1.5倍濃度聚乳酸-聚乙二醇共聚物；(3)利用更大分子量(15k)的聚乳酸以及(4)用戊二醛進一步交聯血紅蛋白納米微囊。
當以上因素中只有3種共同作用時，循環周期與前面相比略有延長。因此，在輸入2分鐘后，與早前血紅蛋白納米微囊的3.05克/100毫升(標準誤差為0.04)相比，非紅細胞血紅蛋白的最大濃度是3.6583g/dl(標準誤差為0.03)，消逝曲線的斜率也相對慢得很多，但更重要的是，非紅細胞血紅蛋白水平在大鼠和人體內分別經過24.2和41.5小時才降低到1.67g/dl(見表3，圖5)。
如果把上述結果類推到人體，可以預期，最近描述的血紅蛋白納米微囊(“1.5 Conc(15k)(XL-Ecap，XL4)”配方)的有功能活性的循環半衰期將達到41小時。這是一個非常明顯且重要的對循環半衰期的延長，可以使被包裹的血紅蛋白具有更長時間的功能，從而提供了一種非常有前景的血液替代品。與聚血紅蛋白相比，血紅蛋白納米微囊在人體內可能有更長的循環周期。這是因為老鼠的網狀內皮細胞系統(RES)在除去像納米微囊這樣的微粒方面比清除聚血紅蛋白溶液效率更高。聚血紅蛋白納米微囊的另外一個優勢在于即使聚血紅蛋白在輸入后泄露，它仍將繼續發揮作用，不會導致任何副作用。完全可以預計，本發明的納米微囊可用作其它修飾血紅蛋白，包括重組血紅蛋白和其它有治療意義的試劑的有用載體。
例V高鐵血紅蛋白的阻止和轉化隨著在體內37℃下循環的血紅蛋白量的增加，高鐵血紅蛋白的量會穩定增長。在紅細胞內，酶系統阻止了血紅蛋白向高鐵血紅蛋白的氧化。在缺少這些酶的情況下，高鐵血紅蛋白隨著體內循環時間的增加而形成。相應地，當血紅蛋白應用于本發明中涉及的納米微囊時，本發明提供的另外的實施例可用來抑制高鐵血紅蛋白的累積。
本發明的一個實施例是把所有正常存在于紅細胞中的酶與血紅蛋白一起放入納米微囊。本發明的另一個實施例是提供了一種納米微囊的組分，該組分對于一些外部因子，如自然存在于血液中可以在體內抑制高鐵血紅蛋白累積的維生素C或谷胱甘肽，具有滲透性。例如，本發明的納米微囊的成分可以這樣制備，使它保留了象血紅蛋白這樣的大分子。同時，它也可以選擇性地透過一些小分子，比如維生素C或谷胱甘肽。
目前，本發明中被納米微囊包裹的血紅蛋白在輸入到37℃人體中后會緩慢地轉換為高鐵血紅蛋白。與血紅蛋白不同，高鐵血紅蛋白不再能攜帶和輸送氧氣。如果納米微囊膜如上文所述能制備成具有選擇透過性，這樣在保留血紅蛋白的同時，微囊膜可以允許維生素C、谷胱甘肽或其它類似的物質從循環的血漿中擴散到納米微囊內。因為這些分子有助于防止血紅蛋白向高鐵血紅蛋白的轉化，這樣就增強了血紅蛋白攜帶和輸送氧氣的能力。
我們制備了包含有血紅細胞中所有酶的血紅蛋白納米微囊。該微囊的制備使用了除了血紅細胞膜外的所有內容物?；谶@個目的，我們可以用上文提到的任何步驟，尤其是那些使體內循環的半衰期延長的方法來制備血紅蛋白納米微囊。我們制備的血紅蛋白納米微囊具有較高的高鐵血紅蛋白水平(7％)。然后我們在37℃下加熱這些納米微囊，并且跟蹤高鐵血紅蛋白所占百分比的變化。
當懸浮于含有100mg/dl毫升葡萄糖的林格乳酸溶液中時，高鐵血紅蛋白在6小時增加了2.5％。另一方面，當懸置在含有100mg/dl葡萄糖和0.02mM還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的林格乳酸溶液中時，高鐵血紅蛋白在第一個小時內增加，恰如上文所述。然而，當葡萄糖和還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸進入納米微囊開始多種酶反應，高鐵血紅蛋白在5小時內以1.5％的速率遞減。這個結果非常令人興奮，因為它顯示出我們僅僅需要把新鮮的紅細胞內容物中正常量的高鐵血紅蛋白還原酶裝入微囊。這樣，100毫克葡萄糖(以血糖提供)和0.02mM還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在懸置介質中不僅可以阻止高鐵血紅蛋白的形成，而且可以把高鐵血紅蛋白轉換回血紅蛋白。通過進一步優化還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的濃度，這種效果會進一步加強。
當懸置在含有100mg/dl葡萄糖和0.02mM還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的林格乳酸溶液中時，高鐵血紅蛋白增加的速率同其懸置于在含有100mg/dl葡萄糖的林格乳酸溶液中時一樣。這是因為，與還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)不同，較大的輔因子還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)不能滲入納米微囊。因為還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)無法滲透，它可以被裝入納米微囊內部。這樣避免再提供外部輔因子的需要，而且使反應可以像在紅細胞內部一樣進行。循環的血液包含了差不多100mg/dl葡萄糖。葡萄糖可進入納米微囊與還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和多酶體系一起發揮作用。對于紅細胞，血糖可以通過紅細胞膜轉運進入紅細胞。
血漿中含有防止高鐵血紅蛋白形成的物質，如維生素C和谷胱甘肽。我們把本發明中的血紅蛋白納米微囊懸置于維生素C、谷胱甘肽或亞甲基藍溶液中。血紅蛋白納米微囊膜對所有這些物質具有透過性。結果，在輸入后，納米微囊中的血紅蛋白就會曝露于血液循環中抑制高鐵血紅蛋白形成的這些因子中。依據本發明的一個實施例，其它通常存在于紅細胞中的物質，包括但不限于酶，如過氧化氫酶、過氧化歧化酶和高鐵血紅蛋白還原酶及其它的輔因子等可以同血紅蛋白一起被包入微囊中。
我們完全可以預期本發明適用于制備納米微囊用來包裹具有有效治療濃度的，有治療意義的其它試劑，包括大分子物質。
相應地，本發明所述的納米微囊的組成可以包含多種有治療意義的試劑和/或分子，對藥物接受者產生一個期望的結果。而且，本發明所述的納米微囊組分可以選擇性地透過有治療意義的試劑和/或分子，以使它們透過納米微囊膜與包入微囊的試劑相互作用。
本發明提供了一個有效傳輸系統來將微囊中包裹的試劑傳輸到體循環中。本發明也提供了一個適于將具有治療意義的試劑逐步釋放到體內循環的傳輸系統。按照這個實例，這一系列納米微囊組分中，每一個都有一個可預先確定的釋放速率，來釋放微囊中的有治療意義的試劑。將所有這些不同組分同時注入體內，就會達到一個可控的逐步的釋放過程。
盡管本發明是通過實施例來描述的，人們應該理解本發明可以進一步修飾。本發明申請有意涵蓋任何在基本發明原理內的變化、應用或改編，包括可知的或慣例的屬于本發明范疇的偏離，也包括對前面闡述的以及后面附加權利要求內容中所講的關鍵部分的偏離。
權利要求
1.一種可降解的多聚納米微囊膜組分，其可用于包囊具有治療意義的試劑并增強在體內的循環時間，所述的納米微囊膜組分由聚乳酸和聚乙二醇的共聚物組成，該共聚物溶于丙酮，不溶于水。
2.根據權利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，所述的納米微囊膜組分進一步包含脂質成分。
3.根據權利要求2所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的脂質成分的量少于聚乳酸和聚乙二醇中每一種的量。
4.根據權利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的聚乳酸的分子量范圍是從5K到25K。
5.根據權利要求4所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的聚乳酸的分子量至少10K。
6.根據權利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的聚乙二醇的分子量至少2,000。
7.根據權利要求6所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的聚乙二醇是甲氧基聚乙二醇。
8.根據權利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，所述的納米微囊膜組分的體內循環半衰期為至少35小時。
9.根據權利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的有治療意義的試劑是大分子物質。
10.根據權利要求9所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的大分子是血紅蛋白。
11.根據權利要求9所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的有治療意義的試劑是交聯的大分子鏈。
12.根據權利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的有治療意義的試劑可交聯到納米微囊膜組分的內表面。
13.根據權利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，所述的納米微囊膜組分還提供一個具有對包裹的有治療意義的試劑選擇性透過的膜。
14.根據權利要求2所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的脂質成分是磷脂。
15.根據權利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，所述的納米微囊膜組分可進一步調整從而能在體內保持住有治療意義的試劑，使其循環半衰期達到至少14小時。
16.一種血紅蛋白納米微囊組分，所述的組分由可生物降解的多聚納米微囊膜包裹有治療效果濃度的血紅蛋白制品；所述的納米微囊膜包括由聚乳酸和聚乙二醇形成的共聚物；該共聚物溶于丙酮，不溶于水；所述的納米微囊組分可以增強血紅蛋白制品的體內循環時間。
17.根據權利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的可降解的多聚納米微囊膜組分還包括脂質成分。
18.根據權利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的脂質成分是磷脂。
19.根據權利要求17所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的脂質成分的量少于聚乳酸和聚乙二醇每一種的量。
20.根據權利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的聚乙二醇是甲氧基聚乙二醇。
21.根據權利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的聚乳酸的分子量范圍是從5K到25K。
22.根據權利要求21所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的血紅蛋白是交聯的血紅蛋白鏈或聚血紅蛋白。
23.根據權利要求21所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中共聚物的濃度可以增加來使納米微囊膜的厚度加大。
24.根據權利要求20所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的聚乙二醇的分子量為2,000。
25.根據權利要求21所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的聚乳酸的分子量為15K。
26.根據權利要求22所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的交聯血紅蛋白鏈的分子量范圍為240K到360K。
27.根據權利要求22所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的血紅蛋白鏈進一步交聯到納米微囊的內表面。
28.根據權利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，所述的血紅蛋白納米微囊組分包含至少一種其它已知的可以抑制高鐵血紅蛋白生成的試劑。
29.根據權利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，所述的血紅蛋白納米微囊組分可被進一步調整以具有選擇性地讓受體體內循環系統的生物物質通過。
30.根據權利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的納米微囊組分可使血紅蛋白制品在體內循環半衰期達到至少14小時。
31.一種可以增加體內循環時間的納米微囊組分的制備方法，其包括(a)加熱聚乳酸和聚乙二醇(PLA-PEG)的混合物；(b)加入含有有治療意義試劑的水溶液到上述混合物中；(c)從上述水溶液中沉淀出共聚物以獲得納米微囊組分；(d)從中提取納米微囊組分；其中所述的組分包括一種可生物降解的包裹了有治療意義試劑的多聚納米微囊膜。
32.根據權利要求31所述的制備方法，其中所述的共聚物溶于丙酮，不溶于水。
33.根據權利要求31所述的制備方法，其中所述的共聚物還包括一種脂質成分。
34.根據權利要求31所述的制備方法，其中所述的脂質成分是磷脂。
35.根據權利要求31所述的制備方法，其中所述的加熱步驟是在有催化劑存在下進行的。
36.根據權利要求35所述的制備方法，其中所述的催化劑是2-乙基己酸亞錫。
37.根據權利要求31所述的制備方法，該方法還包括在將所述水溶液加入到共聚物混合液之前預先交聯所述的有治療意義的試劑。
38.根據權利要求37所述的制備方法，其中所述的交聯包括把交聯試劑與所述水溶液混合至少2小時。
39.根據權利要求38所述的制備方法，其中所述的交聯試劑是戊二醛。
40.根據權利要求38所述的制備方法，其中所述的交聯試劑的濃度至少為0.25M。
41.根據權利要求38所述的制備方法，其中所述的交聯試劑與有治療意義的試劑的比例至少為6∶1。
42.根據權利要求31所述的制備方法，其中聚乳酸-聚乙二醇混合物中聚乳酸組分的分子量至少為10,000。
43.根據權利要求42所述的制備方法，其中聚乳酸-聚乙二醇混合物中聚乙二醇組分的分子量至少為2,000。
44.根據權利要求37所述的制備方法，其中所述的交聯過程包括將交聯試劑與所述的水溶液混合大約5小時。
45.根據權利要求39所述的制備方法，其中交聯試劑是0.5M的戊二醛。
46.根據權利要求41所述的制備方法，其中所述的交聯試劑與有治療意義的試劑的比例為16∶1。
47.根據權利要求41所述的制備方法，該方法還包括將被包裹的有治療意義的試劑交聯到納米微囊的內膜。交聯時先將聚乳酸-聚乙二醇混合物與有治療意義的試劑混合，然后再加入交聯試劑。
48.根據權利要求47所述的制備方法，其中所述的交聯試劑是戊二醛。
49.根據權利要求31所述的制備方法，其中所述的有治療意義的試劑是大分子物質。
50.根據權利要求49所述的制備方法，其中所述的大分子物質是血紅蛋白。
51.根據權利要求49所述的制備方法，其中所述的有治療意義的試劑是一種蛋白、酶、基因、RNA或DNA片段。
52.根據權利要求31所述的制備方法，其中所述的聚乳酸的分子量范圍是5K-25K。
53.根據權利要求52所述的制備方法，其中所述的分子量至少是10K。
54.根據權利要求31所述的制備方法，其中加熱所述的共聚物混合液時，應加熱到至少180℃。
55.根據權利要求53所述的制備方法，其中所述的分子量范圍是15K-25K。
56.根據權利要求55所述的制備方法，其中所述的加熱所述的共聚物的混合液時，應加熱到至少200℃。
57.根據權利要求31所述的制備方法，其中被包裹的試劑的循環時間也得到了延長。
58.根據權利要求50所述的制備方法，其中所述的大分子物質是聚血紅蛋白。
59.一種能夠延長有治療意義試劑的體內循環時間的傳輸系統，所述的系統包括可生物降解的多聚納米微囊組分，該納米微囊組分由共聚物膜包裹有治療意義的試劑而組成；其中所述的共聚物膜包括聚乳酸和聚乙二醇的共聚物，并且溶于丙酮而不溶于水；所述的共聚物膜能夠調整用來使被包裹的有治療意義的試劑以可控速率釋放到體內循環系統。
60.根據權利要求59所述的傳輸系統，其中所述的有治療意義的試劑是大分子物質。
61.根據權利要求60所述的傳輸系統，其中所述的大分子物質是血紅蛋白。
62.根據權利要求61所述的傳輸系統，其中所述的大分子物質是聚血紅蛋白。
63.根據權利要求59所述的傳輸系統，其中所述的共聚物膜還包括一種脂質成分。
64.根據權利要求59所述的傳輸系統，其中可生物降解的多聚納米微囊組分可被進一步調整以具有選擇性地讓受體體內循環系統的生物物質通過。
65.根據權利要求59所述的傳輸系統，其中所述的納米微囊組分能被進一步調整以將其它生物物質與有治療意義的試劑共同包囊。
66.根據權利要求59所述的傳輸系統，其中所述的有治療意義的試劑與共聚物膜的內表面交聯。
67.根據權利要求60所述的傳輸系統，其中所述的大分子物質是一種交聯的大分子鏈。
68.根據權利要求63所述的傳輸系統，其中所述的脂質成分是磷脂。
69.一種能夠在體內逐級釋放有治療意義試劑的傳輸系統，所述的傳輸系統由多種能以不同釋放速度釋放被包裹的有治療意義試劑的可生物降解的多聚納米微囊組分組成；其中每一種所述的可生物降解的多聚納米微囊包括由聚乳酸和聚乙二醇的共聚物構成的共聚物膜，所述的共聚物能夠溶于丙酮，不溶于水。
70.根據權利要求69所述的傳輸系統，其中所述的有治療意義的試劑是大分子物質。
71.根據權利要求70所述的傳輸系統，其中所述的大分子物質是血紅蛋白。
72.根據權利要求71所述的傳輸系統，其中所述的大分子物質是聚血紅蛋白。
73.根據權利要求69所述的傳輸系統，其中所述的共聚物膜還包括一種脂質成分。
74.根據權利要求69所述的傳輸系統，其中可生物降解的多聚納米微囊組分可被進一步調整以具有選擇性地讓受體體內循環系統的生物物質通過。
75.根據權利要求69所述的傳輸系統，其中所述的納米微囊組分可被進一步調整以將其它生物物質與有治療意義的試劑共同包囊。
76.根據權利要求69所述的傳輸系統，其中所述的有治療意義的試劑與共聚物膜的內表面進行交聯。
77.根據權利要求70所述的傳輸系統，其中所述的大分子物質是一種交聯的大分子鏈。
78.根據權利要求73所述的傳輸系統，其中所述的脂質成分是磷脂。
79.一種納米微囊組分，由可生物降解的多聚納米微囊膜包裹具有有效治療濃度的大分子物質構成；所述的納米微囊膜由聚乳酸和聚乙二醇的共聚物組成；該共聚物能夠溶于丙酮，不溶于水；所述的納米微囊組分能夠進行調整以延長其包裹的大分子物質在體內的循環時間。
80.根據權利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的可生物降解的多聚納米微囊膜還包括一種脂質成分。
81.根據權利要求80所述的納米微囊組分，其中所述的脂質成分是磷脂。
82.根據權利要求81所述的納米微囊組分，其中所述的磷脂成分在微囊中的量低于聚乳酸和聚乙二醇中每一種的量。
83.根據權利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的聚乙二醇是甲氧基聚乙二醇。
84.根據權利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的聚乳酸的分子量范圍為5K-25K。
85.根據權利要求84所述的納米微囊組分，其中所述的大分子是一種交聯大分子。
86.根據權利要求84所述的納米微囊組分，其中可用提高共聚物濃度的方法使納米微囊膜的厚度增加。
87.根據權利要求83所述的納米微囊組分，其中所述的聚乙二醇的分子量為2,000。
88.根據權利要求84所述的納米微囊組分，其中所述的聚乳酸的分子量為15k。
89.根據權利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的大分子物質進一步交聯到納米微囊的內表面。
90.根據權利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的納米微囊組分還能進一步調整以使體內循環系統的分子能夠選擇性地透過。
91.根據權利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的納米微囊組分能夠調整以使所述大分子物質在體內循環的半衰期達到至少14小時。
全文摘要
本發明公開了一種可生物降解的多聚納米微囊及其應用。此納米微囊適于包裹有治療意義的試劑，以此增加其體內循環時間。
文檔編號A61P31/00GK1564680SQ02819847
公開日2005年1月12日 申請日期2002年8月28日 優先權日2001年8月31日
發明者托馬斯·M·S·張, 俞衛萍, 道格拉斯·波溫達 申請人:麥吉爾大學