專利名稱：用于制備富含活性成分的銀杏葉提取物的方法
技術領域：
本發明涉及用于制備富含活性成分的銀杏葉提取物的方法。
目前，一些基于銀杏葉提取物的標準植物藥物制劑被用來治療腦及外周血管性疾病，尤其是在歐洲、美國及遠東。
目前使用最為廣泛的銀杏提取物(EGb761)含有24％的黃酮糖苷；3％的銀杏內酯(ginkgolide)A、B、C和J的總和以及3％的白果內酯(bilobalide)(參見K.Drieu，La Presse Medicale(1986)，15，1455-1457)?；颊叩耐扑]日劑量為120mg。
例如，美國專利5,399,348介紹了一種用于制各銀杏提取物的方法，所述提取物的平均組成為24％的黃酮糖苷，3％的銀杏內酯A、B、C和J以及3％的白果內酯。這種方法包括以下步驟i.萃取用含有以重量計40％的水的丙酮萃取干葉粉末；ii.去脂在減壓條件下濃縮萃取物直至濃縮物含有約30％的固體，從而除去丙酮，然后用水稀釋以使固體濃度為15％，使所得到的懸浮液冷卻至約10℃持續1小時，然后過濾除去脂質沉淀；iii.富集有機相向水性過濾液中加入30％的硫酸銨溶液，然后用甲乙酮和丙酮的混合物(9∶1至4∶6)進行液-液萃取并濃縮有機相，以使固體濃度為50％至70％；iv.除去鞣質用水和乙醇的以重量計50/50的混合物稀釋以上濃縮物，以使固體濃度為10％，加入鉛鹽水溶液直至溶液顏色從棕褐色變成琥珀色，并過濾鉛-鞣質沉淀物以得到透明的過濾液；v.清除不溶性硫酸鹽形式的鉛濃縮以上過濾液以使乙醇比例保持在5％以下，加入硫酸銨使其濃度達到約20％，隨后用甲乙酮和乙醇的混合物(8∶2至1∶1)進行液-液萃?。缓蛌i.干燥終產物濃縮有機相以使固體濃度為50％至70％，并在60至80
℃的烘箱中于真空下干燥，以分離得到含水低于5％的終產物。
在過去的十年中，已有許多研究致力于富集銀杏提取物中的活性化合物部分并同時降低長鏈烷基酚類致敏化合物如銀杏酚酸部分。
有相當數量的專利申請以及專利都介紹了可用來獲得富含黃酮糖苷和萜烯內酯的銀杏葉提取物的方法。
例如，美國專利5,389,370涉及用于制備濃縮了活性化合物的提取物的方法。其中所使用的方法是將通過液-液萃取而獲得的富含黃酮糖苷的部分與用柱色譜分離得到的白果內酯和銀杏內酯混合，以獲得所需的組合物，所述組合物通常含有50％的黃酮糖苷和6％的白果內酯；50％的黃酮糖苷和7％的銀杏內酯；或者50％的黃酮糖苷和6％的白果內酯以及7％的銀杏內酯。所述方法采用了上述美國專利5,399,348的方法的前兩步(其在此定義為步驟1和2)，接著加入了以下連續的步驟3.富集有機相用乙酸乙酯和己烷(9∶1)的混合物進行液-液萃取，再用正丁醇重新萃取水相，并將得到的正丁醇相濃縮至干燥，以獲得富含黃酮糖苷的部分；4.活性碳處理用水洗滌乙酸乙酯-己烷相，然后用活性碳處理洗過的乙酸乙酯-己烷相，過濾并濃縮至干燥；5.重結晶將固體殘渣溶解在以重量計50/50的乙醇和水的混合物中，冷卻結晶并過濾，以獲得銀杏內酯；6.柱色譜分離將步驟5的上清液濃縮至干燥，并在硅膠柱上進行色譜分離，以獲得富含銀杏內酯和白果內酯的部分；和7.混合各部分將步驟3的富含黃酮糖苷的部分與步驟5或6的銀杏內酯和/或與步驟6的白果內酯混和。
根據以上方法的一個實施方案，步驟4和5可用柱色譜代替。
此外，美國專利6,030,621介紹了一種用于獲得富含黃酮糖苷和萜烯內酯的銀杏提取物的方法，所使用的方法與美國專利5,389,370中的方法類似將富含黃酮糖苷的部分與通過柱色譜法獲得的富含萜烯內酯的部分混合。通常，所制備的提取物包含47.2％的黃酮糖苷和6.3％的萜烯內酯，或者70％的黃酮糖苷和10％的萜烯內酯。此方法包括以下步驟a)萃取用含有以重量計50％的水的乙醇萃取干葉粉末；b)脫脂在減壓條件下濃縮提取物直至除去乙醇，用水稀釋濃縮物，將混合物靜置48小時，并過濾脂質沉淀；c)捕集活性化合物使水性濾液通過由XAD-4樹脂(多孔聚合物的混合物)和聚酰胺的混合物組成的樹脂，以收集活性化合物；d)洗脫活性成分依次用含有以重量計30、60和90％的乙醇的乙醇/水混合物洗提活性化合物；和e)合并步驟d中得到的所有部分，蒸發除去乙醇，用己烷洗滌此水性濃縮物，并將洗過的水性濃縮物蒸發至干燥，以獲得含有47.2％的黃酮糖苷和6.3％的萜烯內酯的提取物。
在上述方法的一個實施方案中，對從含有30％乙醇的乙醇/水混合物中得到的部分進行快速色譜分離，以獲得至少含80％的萜烯內酯的部分。以同樣的方式，將從含有60％乙醇和90％乙醇的乙醇/水混合物中得到的部分合并，并對其進行快速色譜分離，以獲得至少含80％的黃酮糖苷的部分。將至少含80％黃酮糖苷的部分與至少含80％萜烯內酯的部分以不同的比例混合，可以獲得含有高達70％的黃酮糖苷和10％的萜烯內酯的提取物。
由于健康安全的要求日益嚴格，所以希望使用盡可能純的活性成分。因此，銀杏提取物的趨勢終將是停止使用如EGb761的提取物而使用更加富含活性成分的提取物。通常，可能的目標提取物是含有至少以重量計50％的黃酮糖苷和以重量計12％的萜烯內酯，或是含有至少以重量計30％的萜烯內酯和以重量計15％的黃酮糖苷。美國專利5,389,370或6,030,621的方法可用來獲取這種提取物，但是當用于工業規模時，所述方法卻被證明是非常復雜的，主要是因為采用了色譜分離的步驟。
本申請人已開發了一種不使用任何色譜分離步驟而獲得符合上述標準的銀杏葉提取物的方法。
因此，本發明的一個主題是用于制備銀杏葉提取物的方法，其包含以下連續的步驟i.用含水以重量計不超過20％的乙醇提取干燥的銀杏葉碎片；ii.在氯化鈉水溶液存在下減壓濃縮提取物，并從剩余的透明溶液中除去黑色油狀物；iii.用正己烷、正庚烷或環己烷進行液-液萃取，以洗滌殘余的水溶液；iv.用乙酸乙酯對洗滌過的水相進行液-液萃??；v.用氯化鈉溶液洗滌步驟iv中獲得的乙酸乙酯相，然后將洗滌過的乙酸乙酯相蒸發至干燥。
本申請中的干燥的銀杏葉碎片是指粒度不超過5mm的干燥碎片。
優選地，本發明的干燥的銀杏葉碎片是干粉末的形式。在本申請中，粉末是指粒度不超過1mm的粉末(優選不超過5mm)。
本發明的方法可用于-凍干的銀杏葉碎片(優選粉末)，在該情況下可獲得含有至少以重量計50％的黃酮糖苷和以重量計12％的萜烯內酯的提取物；-或干燥的銀杏葉碎片(優選粉末)，在該情況下可獲得在下文中被稱為“主要提取物”的提取物，所述主要提取物含有至少以重量計30％的萜烯內酯和以重量計15％的黃酮糖苷(用所述方法還可以獲取所述提取物的相關產品-在下文中被稱為“相關提取物”，即與PCT專利申請WO96/33728中介紹的提取物類似的提取物，它含有以重量計約30至35％的黃酮糖苷和以重量計約1％的萜烯內酯)。
根據本發明的一個實施方案，上述方法被用于凍干的銀杏葉碎片(或粉末)，并且所獲得的提取物優選含有以重量計約52％的黃酮糖苷和以重量計約13％的萜烯內酯。
根據本發明的一個優選的實施方案，上述方法被應用于干燥的銀杏葉碎片(或粉末)，并且所獲得的主要提取物優選含有以重量計34至46％的萜烯內酯和以重量計18至30％的黃酮糖苷。更為優選的是，將上述方法應用于干燥的銀杏葉碎片(或粉末)，所獲得的主要提取物含有以重量計36至44％的萜烯內酯和以重量計18至30％的黃酮糖苷。特別地，上述方法被應用于干燥的銀杏葉碎片(或粉末)，所獲得的主要提取物將含有以重量計約40％的萜烯內酯(其中含有以重量計約24.5％的銀杏內酯A、B和C和以重量計15.5％的白果內酯)和以重量計約24％的黃酮糖苷。
優選地，步驟i中的提取是用含有以重量計10至20％水的乙醇、更優選含有以重量計15至20％水的乙醇進行的。
優選地，將步驟ii中在氯化鈉水溶液存在下減壓濃縮后得到的混合物冷卻至例如約10℃的溫度，優選持續10或15分鐘至1或2小時，然后再從所得的透明溶液中除去黑色油狀物。更優選的是，可將硅藻土加入步驟ii中在氯化鈉水溶液存在下減壓濃縮后得到的混合物中，并在冷卻此混合物之前將其中存在的所有乙醇蒸發除去。
同樣優選的是，步驟iii中的洗滌使用的是正庚烷。
根據本發明方法的特別優選的實施方案，當將所述方案用于干燥的銀杏葉碎片(或粉末)時，對步驟iii中經洗滌的剩余水溶液的體積和溶液中氯化鈉的量預先進行調整，一方面使水溶性固體的含量以重量計達到約溶液總重量的8％，另一方面使氯化鈉的含量以重量計達到溶液總重量的16％。水溶性固體的含量的測定方法是取乙醇溶液樣本，蒸發除去乙醇，然后用二氯甲烷萃取，將殘余的水相蒸發至干燥并稱重，然后可以從所獲得的固體殘余物的質量推導出水溶性固體的含量。
步驟iv中，可以任選使用含有以體積計2至10％的丙酮或乙醇的甲基乙基酮替代乙酸乙酯。
步驟ii和v中所使用的氯化鈉水溶液的濃度優選含有以重量計至少10％的氯化鈉，而對于步驟v，氯化鈉的濃度優選是飽和的。
根據應用于干燥的銀杏葉碎片(或粉末)的上述方法的一個優選的實施方案，在步驟iv的液-液萃取結束時獲得的鹽水溶液相可通過一種方法進行再處理，所述方法包括a)用約1∶1的乙酸乙酯和乙醇的混合物進行液-液萃取；和b)將步驟a)結束時獲得的有機相蒸發至干燥；c)將步驟b)中所獲得的剩余物溶解于無水乙醇中，以使固體濃度相對于醇溶液的質量以重量計約為5％至10％。
d)將混合物冷卻至優選10℃或10℃以下(例如2至8℃)的溫度，優選冷卻時間持續30分鐘至12小時；e)過濾并蒸發所得到的過濾液中的乙醇，以得到干燥的提取物。
應用這種附加的方法可以回收得到附加的提取物，其通常含有以重量計約30至35％的黃酮糖苷和以重量計約1％的萜烯內酯。
或者，上述方法在步驟i至v之后，還包括以下步驟vivi.將干燥的提取物增溶于乙醇中，并將溶液冷卻至優選10℃或10℃以下(例如2至8℃)的溫度，如果有鹽沉淀產生，則過濾除去鹽沉淀，并將得到的溶液蒸發至干燥。
在這種情況下，當將本發明的方法用于工業生產時，優選的方法是在步驟v中僅將有機相濃縮至固體濃度為約50％至70％(而不是將其蒸發至干燥)，然后加入乙醇以使組成為以重量計5至20％的水、以重量計5至20％的固體，其剩余的為乙醇，然后再進行步驟vi。按照這種方式進行可省略干燥步驟。
本發明所獲得的主要提取物可用于制藥或食品行業(例如作為營養補充劑的成分)。因為一方面它們的烷基苯酚類物質的含量低于5ppm(HPLC測量結果)，另一方面，它們含有低于0.3％的前翠雀素(prodelphinidine)(優選低于0.25％，一般為0.05％至0.25％)。此外，它們還含少量的親脂性雜質和多糖、除前翠雀素外的其它原花色素(proanthocyanidine)以及高分子量蛋白。
特別地，由于其前翠雀素的含量低，本發明的主要提取物更適于通過靜脈途徑向患者施用。相比之下，市售的提取物如EGb761等含有高達1.5％的前翠雀素。
此外，優選本發明的主要提取物的色譜圖中對應于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-四羥基-3’，4’，5，7-黃酮醇(或槲皮素3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)和O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-三羥基-4’，5，7-黃酮醇(或莰非醇3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)的峰面積的和占色譜峰總面積的約39％。具體地講，優選本發明的主要提取物的色譜圖中對應于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-四羥基-3’，4’，5，7-黃酮醇(或槲皮素3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)的峰面積占色譜峰總面積的約20％。類似地，優選本發明的主要提取物的色譜圖中對應于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-三羥基-4’，5，7-黃酮醇(或莰非醇3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)的峰面積占色譜峰總面積的約19％。
此外，使用本發明的方法所得的相關提取物含有低于0.5％的前翠雀素(優選低于0.4％，一般為0.15至0.40％)。
本發明的另一個主題是可通過本發明的方法獲得的主要提取物。本發明的主題還有作為藥物的所述主要提取物、包含所述主要提取物作為活性成分的藥物組合物以及所述主要提取物用于制備藥物的用途，所述藥物可用來治療選自以下的疾病/障礙腦和外周血管障礙(如血管源性耳鳴、動脈硬化、局部缺血、血栓、與靜脈機能不全有關的癥狀、急性靜脈炎癥以及與痔疾有關的癥狀)、神經退化性疾病(如例如阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨庭頓舞蹈病或肌萎縮性側索硬化癥)以及老年慢性神經感官和認知性病理缺陷(尤其是在未患阿爾茨海默氏病或其它癡呆的老年病人中可見的記憶喪失)。最后，本發明的主題是所述主要提取物用于制備藥物的用途，所述藥物可為治療增殖性疾病(尤其是癌癥)提供輔助治療。
含有本發明提取物的藥物組合物可以是固體形式如，例如粉末劑、丸劑、顆粒劑、片劑、脂質體、明膠膠囊或栓劑。丸劑、片劑或明膠膠囊可以用一種物質進行包衣，所述物質能夠保護組合物在足夠的時間段內免受受試者的胃酸或胃中的酶的作用，以使這種組合物能夠未經消化而進入受試者的小腸。所述提取物也可以局部施用，例如施用于腫瘤的實際部位。所述提取物也可以根據緩釋方法施用(例如使用緩釋組合物或滲透泵)。合適的固體載體包括磷酸鈣、硬脂酸鎂、碳酸鎂、滑石粉、蔗糖、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯呲咯烷酮和蠟。
含有本發明提取物的藥物組合物也可以是液體形式如，例如溶液劑、乳劑、混懸液或緩釋制劑。適合的液體載體可以是例如水、有機溶劑如甘油或乙二醇類如聚乙二醇，或在水中的這些有機溶劑的不同比例的混合物。
本發明的藥物的施用可以通過局部、口服、胃腸外途經、經肌肉內注射等方式進行。
本發明的提取物用于治療上述疾病或障礙時的劑量隨施用方法、待治療患者的年齡和體重及其身體狀況而變化，并且最終由醫生或獸醫決定。這種由醫生或獸醫所確定的量在此被稱為“治療有效量”。
如果預先不考慮醫生的意見，根據主要提取物中的活性成分的含量，可以例如設計施用的日劑量為5至150mg、優選10至100mg(特別是40至80mg，例如50至70mg的劑量)的所述主要提取物。
在本申請中，術語“約”指的是所討論數值周圍的一個區間。如本申請中所使用的“約X”表示從X減X的10％到X加X的10％的區間，并更優選從X減X的5％到X加X的5％的區間。
除非特別指明，這里所使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域一般技術人員通常所理解的含義相同。同樣，所有在此提及的出版物、專利申請、專利以及其它參考資料在此引入作為參考。
以下實施例旨在闡明上述方法而不應當被認為是對本發明范圍的限制。
實施例實施例1將100克凍干研碎的銀杏葉(粒度小于4mm)用含有以重量計88％的乙醇的乙醇/水混合物萃取兩次，第一次用800ml，第二次用600ml，每次都在60℃下進行1小時。將兩次萃取步驟的萃取液過濾，回收剩余的葉片并用200ml相同的溶劑混合物洗滌。合并萃取液并將其蒸發使體積減少至100ml，其中固體產物的含量約35g。將350ml 10％(重量)的氯化鈉水溶液加入到醇濃縮物中，并在50℃下繼續減壓蒸發以除去剩余的乙醇。將淺桔黃色的透明鹽溶液傾析通過過濾漏斗中的棉毛球然后抽吸濾過硅藻土而與黑色油狀物分離，將鹽水溶液中的提取物用每份150ml的正庚烷洗滌兩次，然后再用每次150ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并乙酸乙酯相并用50ml飽和氯化鈉水溶液洗滌，然后減壓蒸發至干燥。將干提取物重新溶解于60ml的無水乙醇中，置于5℃的冰箱中過夜，過濾以除去可能生成的沉淀鹽并將過濾物蒸發至干燥，得到1.42g含有51.7％的黃酮糖苷和13％的萜烯內酯(6.55％的白果內酯)的提取物。
實施例2將100g在工業轉爐中干燥并經研碎的銀杏葉(粒度小于4mm，含有以重量計1.8％的黃酮糖苷和以重量計0.12％的銀杏內酯)用含有以重量計80％的乙醇的乙醇/水混合物萃取兩次，第一次用800ml，第二次用600ml，每次都在60℃下進行1小時。將兩次萃取步驟的萃取液過濾，回收剩余的葉片并用200ml相同的溶劑混合物洗滌。合并萃取液并將其蒸發使體積減少至800ml，其中固體產物的含量約33g。將60g氯化鈉、100ml水和22g硅藻土加入到醇濃縮物中，并在50℃下繼續減壓蒸發以除去剩余的乙醇。將水性濃縮物冷卻至10℃持續1小時。將淺桔黃色的透明鹽溶液傾析通過過濾漏斗中的棉毛球、然后在覆蓋有一層硅藻土的燒結玻璃漏斗上抽吸過濾而與黑色油狀物分離。用兩份125ml的正庚烷洗滌鹽水溶液(約300ml)中的提取物，然后再用每次125ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并乙酸乙酯相并用50ml飽和氯化鈉水溶液洗滌，然后減壓蒸發至干燥。將干燥的提取物重新溶解于23ml無水乙醇中，置于4℃的冰箱中過夜，過濾以除去可能生成的鹽沉淀并將過濾物蒸發至干燥，得到1.06g含有23.6％的黃酮糖苷、39.2％的萜烯內酯(包括24.6％的銀杏內酯A、B和C以及14.5％的白果內酯)和約0.14％的前翠雀素的提取物。
實施例3
在制備實施例2的提取物的方法中，經正庚烷清洗并用乙酸乙酯萃取的連續步驟后而獲得的水相鹽溶液再用兩份125ml的乙酸乙酯-乙醇的1∶1混合物萃取，將所獲得的有機相蒸發至干燥。將干燥的提取物置于無水乙醇中以使干燥提取物的濃度以重量計為溶液總重的5％。將混合物置于4℃的冰箱中過夜，然后用濾紙過濾(用4℃的無水乙醇沖洗固體)。蒸發至干燥后，得到含有31.88％的黃酮糖苷和0.67％的萜烯(含0.5％的銀杏內酯A、B和C和0.17％的白果內酯)以及約0.21％的前翠雀素的提取物。
本發明提取物的鑒定A)HPLC本發明的提取物可以使用高效液相色譜法(HPLC)鑒定，洗脫梯度如下儀器-適合以下所指定條件的液相色譜儀及設備-實驗室玻璃器皿-精確度至0.1mg的天平試劑-純水(HPLC級)-乙腈(HPLC級)-異丙醇(HPLC級)-檸檬酸(HPLC級)-甲醇R-銀杏提取物標準對照物步驟將200mg待分析的提取物溶解于10ml甲醇中，制得待測提取物溶液。以相同的方法將200mg銀杏提取物標準對照(EGb 761)溶解于10ml甲醇中，制得參比溶液。
使用了以下色譜條件
-梯度類型 二級流動相從0％至100％線性梯度15分鐘，然后以二級流動相洗脫5分鐘。在進行以下進樣前用基礎流動相將色譜柱重新平衡10分鐘。
-基礎流動相純水1000ml乙腈200ml異丙醇 30ml檸檬酸 4.92g-二級流動相純水1000ml乙腈470ml異丙醇 50ml檸檬酸 6.08g-流速 1.5ml/分鐘-檢測 紫外360nm-色譜柱不銹鋼，15cm長，直徑4.6mm，填充有色譜用Macherey-Nagel R Nucleosil 5C18硅膠或同等物(5μm)。
-進樣體積 5μl結果所得到的實施例2提取物的色譜圖由

圖1所示，實施例3的提取物的色譜圖由圖2所示。
以下表I(實施例2的提取物)和表II(實施例3的提取物)中列出了所測定的不同色譜峰的積分值。在上述條件下，主峰的保留時間約為13至15分鐘，分別對應于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-四羥基-3’，4’，5，7-黃酮醇(或槲皮素3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)和O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-三羥基-4’，5，7-黃酮醇(或莰非醇3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)。
表I
表II
B)測定前翠雀素的含量本發明提取物的前翠雀素含量按照以下所述方法進行測定將約50mg提取物溶解于25ml異丙醇和3N鹽酸(5/1v/v)的混合物中。將5ml所得到的混合物轉移至10ml燒瓶中，用液密塞子密封，然后將燒瓶浸于沸水中45分鐘。冷卻至20℃后，加入異丙醇與3N鹽酸的混合物使體積增至10ml。測量556nm處的吸光度并通過進行以下運算得到前翠雀素的百分含量前翠雀素％＝A×86.206897/BA556nm處的吸收度B樣品毫克數為降低結果的不確定性，重復實驗3次并由所得結果計算平均值。
本發明提取物的藥理學特性為證實本發明提取物的藥理學特性，進行了以下實驗。
1)細胞繁殖細胞系MDA-231乳癌細胞系得自Lombardi癌癥中心(喬治敦大學醫學中心)。將這些細胞在聚苯乙烯培養皿(Corning)中培養并在添加了10％的胎牛血清(FBS)的Dulbecco改進的Eagle培養液(DMEM)中進行增殖。
結合實驗將MDA-231細胞通過研磨分散于5ml磷酸鹽緩沖的鹽水溶液(PBSS)中，然后在500g下離心15分鐘。將經過離心的細胞重新懸浮于PBSS中并進行測試以確定它們的蛋白含量?？梢园凑铡癙apadopoulos等人，生物化學雜志，1990年，265期，3772-3779頁”和“Hardwick等人，癌癥研究，1999年，59期，831-842頁”中所述的方法進行[3H]PK11195實驗。[N-甲基-3H]PK11195或(1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基-丙基)-3-異喹啉甲酰胺得自Du Pont-New England Nuclear(Wilmington，DE，美國)。PK11195得自Research Biochemicals Incorporated(Natick，MA，美國)。所得到的結果用LIGAND軟件(Munson and Robard，Anal.Biochem.(1976)，72，248-254)進行分析。
Northern RNA分析使用“Hardwick等人，癌癥研究，1999年，59期，831-842頁”中所述的Northern分析法，可以對用實施例1或實施例2中的提取物或EGb761(參比)處理的MDA-231細胞中的外周型苯并二氮雜受體(PBR)的mRNA的表達進行評價。整體細胞RNA是使用試劑RNAzolB(TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX，美國)和三氯甲烷進行分離的。用1％瓊脂膠分離20μg總體RNA樣品并將其過夜轉移至尼龍膜(S&SNytran，Scheicher & Schuell，Keene，NH，美國)上。采用DNA引物的隨機認證系統(Life Technologies，Gaithersbury，MD，美國)，用[α-32P]dCTP標記一段0.2kb長的人PBR的cDNA片段(得自含有人PBR全序列的pCMV5-PBR質粒載體)。所使用的雜交條件在先前所提及的文獻中述及。自動放射顯影是通過在-70℃下將印記(blots)暴光于X-OMAT AR底片(Kodak，Rochester，NY，美國)達4至48小時進行的。使用SigmaGel軟件(Jandel Scientific，San Rafel，CA，美國)對PBR mRNA進行定量。
細胞繁殖用添加了0.1％FBS的DMEM作為細胞培養液，將MDA-231細胞置于96孔板(Corning，NJ，美國)中，濃度為每孔約10,000細胞(溫育24小時)或5,000細胞(溫育48小時)。然后將細胞在含有不同濃度的待測樣品或參考樣品(EGb761)的10％FBS中培養以上指定的時間。通過使用ELISABrDu儀器(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，美國)測量結合的5-溴-2’-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)的量，對細胞繁殖的差異進行分析。BrdU的結合是在450nm的波長下(參比690nm)進行測量的。
2)谷氨酸誘導的神經毒性可按如下方式測試本發明的提取物用一系列濃度的上述實施例1或實施例2的提取物對大鼠腦神經細胞進行處理或未經處理，30分鐘后使其與濃度為250 M的谷氨酸接觸。然后計算抑制50％的谷氨酸毒性的劑量(IC50)，并與用提取物如黃酮糖苷和萜烯內酯的含量較低的EGb761得到的結果進行比較(即每ml含EGb761100μg)。
3)細胞毒性用HT22細胞系(鼠海馬細胞)可測量本發明的提取物對細胞存活能力的影響。通過測定經一系列濃度的上述實施例1或實施例2的提取物處理過的HT 22細胞釋放出的LDH的量以及錐蟲藍排除實驗，可以估計細胞的存活能力。
細胞系HT 22細胞來自于Salk生物學研究所(Salk Institute for BiologicalResearch，La Jolla，CA，美國)。將此細胞用添加有10％的胎牛血清(FBS)的Dulbecco改進的Eagle培養液(DMEM)在37℃下培養。所述培養液在下文中被稱為完全培養液。
實驗程序將HT 22細胞置于96孔板中，濃度為每孔完全培養液中含有5×103個細胞。24小時后，將所述實施例的提取物溶于DMEM中并將其以10、25、50、100、250、500和1000μg/ml的濃度加入細胞培養孔中，然后使提取物與細胞接觸24或48小時。使用Promega分析試劑盒、按照制造商提供的使用說明進行LDH的測量。記錄470nm處的吸收度。最高LDH釋放量是用Triton X-100將細胞完全裂解后得到的。
當通過錐蟲藍排除實驗估算細胞的存活能力時，將細胞置于6孔板中，并于24小時后以100g/ml的濃度加入實施例1或實施例2的提取物。
然后用不含鈣及鎂離子的磷酸鹽緩沖液清洗細胞，再用胰蛋白酶在37℃下處理5分鐘。用完全培養液終止反應，并向細胞懸浮液中加入0.04％的錐蟲藍。用血細胞記數器測定排斥錐蟲藍的細胞(即活細胞)數。按以下公式計算細胞存活百分比活細胞數(未染色細胞)/總細胞數(染色細胞和未染色細胞)×100
權利要求
1.制備銀杏葉提取物的方法，其包括以下連續的步驟i.用含水以重量計不超過20％的乙醇提取干燥的銀杏葉碎片；ii.在氯化鈉水溶液存在下減壓濃縮提取物，并從剩余的透明溶液中除去黑色油狀物；iii.用正己烷、正庚烷或環己烷進行液-液萃取，以洗滌殘余的水溶液；iv.用乙酸乙酯對洗過的水相進行液-液萃?。籿.用氯化鈉溶液洗滌步驟iv中獲得的乙酸乙酯相，然后將洗過的乙酸乙酯相蒸發至干燥。
2.權利要求1的方法，其特征在于其不包括色譜分離步驟。
3.權利要求1或2的方法，其中，步驟i中的干銀杏葉碎片用干銀杏葉粉末代替。
4.權利要求1至3的方法，其特征在于步驟i中的提取是使用含有以重量計10至20％的水的乙醇進行的。
5.權利要求1至4的方法，其特征在于步驟iii中的洗滌是用正庚烷進行的。
6.權利要求1至5的其中一項的方法，其特征在于步驟ii和v中所用的氯化鈉水溶液的濃度為至少含有以重量計10％的氯化鈉。
7.權利要求1至6的其中一項的方法，其在步驟i至v后還包括以下步驟vivi.將干燥的提取物溶于乙醇中并使溶液冷卻，過濾可能產生的沉淀鹽并將得到的溶液蒸發至干燥。
8.銀杏葉提取物，其可以按照權利要求1至7的其中一項所述的制備方法獲得。
9.權利要求8的銀杏葉提取物，其特征在于所述方法是從干燥的干銀杏葉碎片開始進行的。
10.權利要求9的銀杏葉提取物，其特征在于其含有以重量計34％至46％的萜烯內酯和以重量計18％至30％的黃酮糖苷。
11.權利要求8的銀杏葉提取物，其特征在于所述方法是從凍干銀杏葉的干碎片開始進行的。
12.權利要求11的銀杏葉提取物，其特征在于其含有以重量計約52％的黃酮糖苷和以重量計約13％的萜烯內酯。
13.用作藥物的權利要求8至12的其中一項的銀杏葉提取物。
14.藥物組合物，其包含權利要求8至12的其中一項的提取物作為活性成分。
15.權利要求8至12的其中一項的提取物在制備用于治療疾病/障礙的藥物中的用途，所述疾病/障礙選自腦及外周血管障礙和神經退化性疾病。
16.權利要求8至12的其中一項的提取物在制備預計用來為治療增殖性疾病提供輔助治療的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及制備銀杏葉提取物的方法，其包括以下連續的步驟i)用含水以重量計至少20％的乙醇提取干燥的銀杏葉碎片；ii)在至少氯化鈉水溶液存在下減壓濃縮提取物并從剩余的透明溶液中除去黑色油狀物；iii)用正己烷、正庚烷或環己烷進行液－液萃取，以洗滌殘余的水相；iv)用乙酸乙酯對洗過的水相進行液－液萃??；v)用氯化鈉溶液洗滌步驟iv)中獲得的乙酸乙酯相，然后將洗過的乙酸乙酯相蒸發至干燥。
文檔編號A61P9/14GK1501806SQ02808099
公開日2004年6月2日 申請日期2002年4月9日 優先權日2001年4月10日
發明者鄧朋本 申請人:科學研究和應用咨詢公司