專利名稱：利用熱滯后蛋白改良低溫外科中的組織破壞的制作方法
技術領域：
本發明涉及以前與低溫外科不相關的領域，以及熱滯后蛋白(Thermalhysteresis proteins)的性質和利用。
背景技術：
冷凍外科作為一種臨床醫學方法已獲得廣泛的接受，并且其應用范圍還在迅速擴大。其中包括眼內障性晶狀體的切除、視網膜脫離的修復、用以矯正心律失常的部分心臟組織的切除、以及前列腺、肝、腦和其它內臟腫瘤的破壞。低溫外科中利用一個冷凍探針的插入以通過高度定位冷凍作用破壞不需要的組織。一旦該組織凍結，可讓其解凍。然后機體的免疫系統逐漸分解被破壞的組織并將之排出體外。低溫外科具有許多優點，包括其最小限度的侵入性然而高度可控，而且沒有劑量限制。
冷凍探針為細圓筒狀的器具，它用冷凍劑從內部降溫，除尖端外其余部分絕熱。由于冷凍劑通過探針循環，組織的冷凍自尖端向外發生，在冷凍組織及非冷凍組織間形成一個運動的冷凍前沿或分界面，該前沿或分界面是嚴格限定的，并在組織中緩慢傳播(傳播速度為每分鐘幾毫米)。可用小的探針處理相對大的區域；例如一3毫米直徑的探針可產生直徑為3.5厘米的冰球。當病理組織的區域較大且形狀復雜時，相應的接近目的組織的冷凍區域可用幾個探針同時來產生。復合位點可分開處理或同時處理。由于冷凍探針的插入是組織僅有的物理性侵入，該方法帶來的并發癥及病人的發病率得以降低，而且這種方法使患者承擔較少的痛苦和損傷，所有這些使得在低于傳統的侵入性外科的費用的情況下獲得治療效果。
冷凍外科的一個局限性是不能使所有不需要的組織受冷凍或使得許多緊鄰不需要的組織的健康組織有受冷凍的危險。然而，最近非侵入性醫學成像技術的發展已大大降低了冷凍不足(under-freezing)和過冷凍(over-freezing)的危險。例如手術過程中的超聲成像技術可通過在冷凍組織和非冷凍組織間聲阻抗的變化來監測冷凍前沿位置以及冷凍組織的大小、形狀和位置。磁共振成像技術也得以有效應用，它的便利之處在于以三維方式在200微米的分辨率下對冷凍前沿位置成像。
然而，成像技術已暴露出進一步的局限性某種條件下活細胞的冷凍只是保藏了細胞而沒有破壞它們。對何時保藏細胞而不是破壞它們，或者何時破壞細胞而不是保藏它們的解釋，可見于Mazur,P在1970年第168卷第939-949頁的《科學》雜志上“低溫生物學生物系統的冷凍”一文中提出的“兩因子”(即化學因子和機械因子)理論假說中。此理論認為任一給定溫度下冰晶形成的可能性為體積的函數，在較大體積中，冰晶形成的可能性更大。在細胞懸浮液中，此效果導致胞外空間首先形成冰；這是因為胞外空間的體積遠大于單個細胞的胞內體積。由于胞外冰的形成，剩下未結冰溶液中溶質的濃度升高，在細胞周圍形成高滲溶液。在這些(現象)發生時胞內流質仍以液態形式存在，從而在細胞膜兩側形成化學勢。這使得水通過質膜從胞內向胞外流動，留下離子及有機溶質(為膜不透性的)在細胞內。從而細胞脫水并自身變成離滲的，通過化學損害導致細胞的死亡。然而化學損害為時間和溫度的函數，水通過細胞膜的輸送則是一速度依賴過程。因而較低的冷凍速度將因為細胞更長時間暴露在高滲條件下而增加了化學損害的可能性。相反，胞內自身冰晶的形成則被認為是通過機械損害來導致細胞的死亡，冷凍速度增加至某一水平以上可使得水在遷移出細胞前即形成冰核。因而在高冷凍速度的情況下，隨冷凍速度的增加，胞內冰晶形成及隨之發生的細胞死亡的可能性增加而非減少。這兩個相反的細胞破壞模式在用細胞存活率相對于冷凍速度作圖時形成一倒“U”形曲線。除冷凍速度外，其它被認為是影響細胞存活率的因子是溫度梯度、冷凍界面推進的速度、最終冷凍溫度、此溫度下保持的時間、冷凍后升溫的速度和所包括的冷凍-解凍循環數。
在低溫外科中，這些參數特別難以控制，這是因為溫度控制只能從探針尖端獲得，而組織周圍的組成成份又不是一致的。在單個處理過程中，整個被處理區域中會發生一個或多個冷凍參數的變化，這是因為不斷增大的冷凍區域導致不同的組織部分經受取決于這些部分至探針尖端的距離的不同的冷凍速度、最終冷凍溫度和維持時間。除此之外，實施此方法的方式在不同的醫生間和不同的診所間也是不同的。因而，典型的低溫外科手術的結果經常是不可預料的，并且難以控制。
發明總結現在已發現利用低溫外科進行的細胞破壞可用不依賴于冷凍速率、最終冷凍溫度和相關的熱史參數(thermal history parameters)的方式獲得，按照該方式，首先向細胞內灌注一種或多種熱滯后蛋白，然后在繼續向細胞內灌注熱滯后蛋白的過程中用一冷凍探針冷凍細胞。該方法利用該蛋白質的活性控制冰晶生長的方式和方向，本發明部分在于發現以此蛋白質的作用取代其他因子來影響冰晶形成的速度、機制和定位。該蛋白質通過提高和限制胞內冰晶的生長以形成針狀冰晶。這些冰晶通過細胞的機械破壞而導致細胞的死亡，并確保這些效果發生在整個冷凍條件的范圍內，以及排除此范圍各部分對化學損害的依賴的必要。
本發明中的這些和其他一些特征及優點在下面的描述中會變得更明顯。
本發明詳細描述及優選實施例天然大分子種類的被稱為“抗凍蛋白”(antifreeze proteins)、“熱滯后蛋白”(thermal hystersis proteins)、“抗凍糖蛋白”(antifreeze glycoproteins)和“抗凍多肽”(antifreeze polypeptides)的存在已眾所周知并在文獻中大量報道。例如抗凍糖蛋白的發現，最初由DeVries A.L.等在1969年3月7日的《科學》(Science)第163卷第1073-1075頁中“一些南極魚類的抗凍性”一文所報道。DeVries等觀察到一些魚類能一年四季生活于平均水溫為-1.87℃水中，這是由于雖然在它們的血液中缺少足夠量的氯化鈉以及其他一些低分子量物質，但仍能通過一般的冰點降低法降低冰點。DeVries等將這些種類的魚的生存歸因于某種糖基化蛋白質的存在，這些蛋白質分子量范圍從約2,500道爾頓至約34,000道爾頓，它們現在是指抗凍糖蛋白或“AFGPs”。進一步研究表明許多北溫帶和北冰洋魚種在它們的血液中攜有抗凍化合物。其中有些化合物為糖蛋白，而其它一些化合物則沒有糖基半分子，稱之為抗凍多肽或抗凍蛋白(“AFPs”)，它們的分子量范圍從約3,300道爾頓至12,000道爾頓。而且，這些化合物在降低冰點的同時并不影響到熔點，因而稱之為“熱滯后蛋白”。
抗凍蛋白和抗凍糖蛋白可從廣范的來源分離到，這些來源以及從它們中獲得的各類蛋白的結構已在文獻中大量報道。這些蛋白的來源包括魚類和非魚類，列于下面的表Ⅰ和表Ⅱ中。
表Ⅰ魚類的熱滯后蛋白
表Ⅱ非魚源熱滯后蛋白
研究最深入和在本發明的實施中所用的優選蛋白質是從魚類中分離到的。如表Ⅰ中所示，這些蛋白質包括糖基化蛋白(AFGPs)和非糖基化蛋白(AFPs)，后者被分為三個普通種類，文獻中命名和本領域中的專業人員稱之為Ⅰ-型，Ⅱ-型和Ⅲ-型。
雖然有各種變化存在，AFGPs一般由一系列重復的三肽單位(丙氨酰-蘇氨酰-丙氨酰組成，并有二糖β-D-半乳糖基-(1→3)-α-N-乙酰基-D-半乳糖胺接在蘇氨酸殘基的羥基基團上。例如，相對低分子量的AFGPs含有脯氨酸和精氨酸殘基，分別取代了一些丙氨酸和蘇氨酸殘基。對來自于代表魚類的AFGPs的色譜研究揭示了八個主要的分子量成分的存在，如表Ⅲ中所示。
表Ⅲ來自于Pagothenia borchgrevinki中的AFGPs的分子量組分
AFPs間的差別程度大于AFGPs間的差別。如表Ⅰ中所示，三個類型的AFPs間差別在于它們的殘基含量。Ⅰ-型AFPs富含丙氨酸殘基(約為65％)，其余的主要由極性殘基如天冬氨酸，谷氨酸，賴氨酸，絲氨酸和蘇氨酸組成。其分子量范圍從約3,300至6,000。Ⅱ-型AFPs被認為富含胱氨酸(實際上是半胱氨酸)殘基，與C-型凝集素同源。來自于絨杜父魚(sea raven)的Ⅱ-型AFPs含有7.6％的胱氨酸，14.4％的丙氨酸，19％的天冬氨酸和谷氨酸，8％的蘇氨酸。其分子量大小從約14,000至約16,000。Ⅲ-型AFPs缺乏胱氨酸殘基，丙氨酸殘基也不豐富。沒有任何明顯優勢的氨基酸成份存在，極性氨基酸和非極性氨基酸的含量相當。其分子量大小從約5,000道爾頓至6,700道爾頓。本段中所有百分比均以摩爾數為基礎。
昆蟲來源的抗凍蛋白主要是Ⅱ-型AFPs，具有氨基酸殘基典型組分的是來自于樅色卷蛾(Choristoneura fumiferana)(云杉芽卷蛾)和偽步行蟲(Tenebrio molitor)(甲蟲)的抗凍蛋白。這些抗凍蛋白列于表Ⅳ，為了比較，表中也包括絨杜父魚(sea raven)的的氨基酸組成。
抗凍蛋白和抗凍糖蛋白可通過傳統的方法從魚或昆蟲的血清或其他體液中提取。這些蛋白質的分離和純化可可通過層析方法輕易地完成，也可通過吸收，沉淀，以及蒸發的方法完成。其他的方法，其中許多已在文獻中描述，它們對本領域技術人員來說是非常容易明白的。
表ⅣⅡ-型AFPs氨基酸組成比較
熱滯后蛋白也可通過合成的方法產生，用傳統的化學合成方法或是用包括DNA重組的方法。形成這些蛋白質的基因的DNA編碼序列已闡明并被大量報道。例如，見DeVries,A.L.等《生物化學雜志》(J.Biol.chem.)246305(1971)；Lin Y.等《生物化學生物物理研究通訊》(Biochem.Biochem.Biophys.Res.Commun.)46:87(1972)；Yang D.S.C等《自然》(Nature)333:232(1988)；Lin,Y.《美國科學院進展》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78:2825(1981)；Davies P.L.,等，《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.)79:335(1982)；Gourlie B.等《生物化學雜志》(J.Biol.chem.)259:14960(1984)；cott,GK.,等《加拿大魚類水生生物科學雜志》(Can.J.Fish.Aquat.Sci.)；Scott,G.K.,等《分子進化雜志》(J.Mol.Evol.)27:29(1988)。成功地把AFP基因微注射到其它物種而非其來源種中亦已見于報道。例如見Zhu,Z.等(AngewIchthyol)l:31(1985);Chourrout D等《水產養殖》(Aquaculture)51:143(1986)；Dumman R.A.等Trans Am.Fish.Soc.116:87(1987)；Fletcher G.L.等《加拿大魚類水生生物雜志》45:352(1988)；Maclean N.D.等《(生物技術》(BioTechnology)5:257(1987)；Stuart G.W.等《發育》(Development)103:403(1988)；McEvoy,T等《水產養殖》(Aquaculture)68:27(1988)；OzatoK等《細胞分化》(Cell Differ)19:237(1986)。
本發明具體研究的熱滯后蛋白質是那些分子量相對較低的蛋白質，如那些分子量介于約2,000至約10,000之間的，優選約2,600至約6,000,最優選約3,000至約4,000之間的蛋白質。
本發明的實施中，熱滯后蛋白最便于以液體形式給藥，如一種溶液或一組織相容流質中的懸浮液。優選水溶液或生理鹽水[水中含約0.9％(重量/體積)氯化鈉]溶液。為取得最佳效果，溶液或懸浮液中此蛋白的濃度范圍一般從約1mg/mL至約30mg/mL，優選從約1mg/mL至約20mg/mL，最優選從約5mg/mL至15mg/mL。使用時可通過血管系統由目的器官注射、攝食、灌注以注入目的組織中，或使該組織與溶解的蛋白達到飽和和平衡的方法給藥。
一旦組織中灌入熱滯后蛋白，可根據已知技術進行該組織的冷凍切除。將冷凍探針推進到組織的中央，或者將兩個或多個冷凍探針置于組織內所選擇的部位以形成符合被切除組織外形的冷凍區域。探針用復合腔完全包圍以允許在其尾端和背端以一超冷流質環繞。液氮是常用的超冷流質，在-196℃時于冷凍探針的尖端內沸騰。沸騰使得在液氮和冷凍探針的金屬片間產生一絕熱氣體薄膜，此金屬片限制微探針周圍的最低溫度約為-160℃。當尖端為-160℃時，從探針表面向外至2cm處的組織溫度達-20℃或更低。這種一般描述的探針在本領域已熟知，并于文獻中廣泛公開，包括美國專利號第5,147,355號，授予Friedman等(布萊漢和婦女醫院(Brigham and WomensHospital)，波士頓，馬薩諸塞州，美國，1992年9月15日)，和美國專利號第5,437,673號，授予Baust等(低溫醫學科學(Cryomedical Sciences)公司，洛克菲勒，馬里蘭州，美國，1995年8月1日)，以上二者以參考文獻形式在此處被引用。
本發明實施中優選把冷凍探針和同時成像技術(Simultaneous imagingtechnques)、顯著超聲和磁共振成像(notably ultrasound and magnetic resonanceimaging)合并使用。這些技術以傳統的方式使用，它們的使用并不干擾冷凍探針的操作。例如，超聲成像可以二維或三維方式進行，后者是通過計算機重構二維超聲數據以形成三維圖像。超聲成像是通過將一超聲轉導器置于靠近目的組織部位而獲得。例如在前列腺成像中，超聲轉導器可經直腸放置。對上面討論的液氮冷凍探針，溫度低于-20℃的組織區域被一約3毫米厚、其內部溫度升至0℃的環包圍。此環的超聲圖像是一亮回聲(bright echo)。在磁共振成像中則不需將轉導器鄰于冷凍探針放置。冷凍的組織由于根本不產生信號，因而在MRI掃描上呈黑色，由于圖像的剩余部分不受冷凍區域的影響，可檢測到冷凍區域的全部范圍。
更進一步的有關這些成像方法的使用的敘述可于下列出版物中找到，所有這些出版物均以參考文獻形式在此處被引用Onik,G,等，“轉移性結腸癌處理中超聲引導的肝低溫手術”《癌》(Cancer)67(4):901-907(1991)。
Onik,G.,等，“經直腸的超聲引導的經皮膚的根治性低溫手術切除前列腺”《癌》72(4):1291-1299(1993)Rubinsky,B.,“用超聲進行低溫手術成像”《機械工程》MachamicalEngineering)108(3):48-51(1986)。
Rubinsky,B等，“用質子核磁共振NMR監測腦和前列腺的低溫手術”《低溫生物學》(Cryobiology)30:191-199(1993)下用的實施例用來描述而不是為了限制或限定或加以限制本發明的范圍。
實施例材料與方法在下面的實施例中，研究了兩個重要的熱學變量，即致冷速度和細胞冷凍后的最終溫度對細胞破壞程度的影響。該細胞是Narayan,P.等1992年發表于《泌尿科學雜志》(J.Urol.)第148卷第5期第1600-1604頁“人原發前列腺腺癌細胞系(ND-1)的建立和特征”所建立的腺癌細胞系(ND-1)的人前列腺癌細胞培養物，生長于Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)上，補充10％的胎牛血清，100單位/mL的青霉素和100mg/mL的磷酸鏈霉素，置于75cm3的三角瓶中，在含5％CO2濕空氣中37℃溫育。一旦細胞發生貼壁，吸出生長培養基，加入3mL 0.05％的蛋白胨使細胞從三角瓶的壁上脫離。產生的細胞懸浮液離心以吸除胰蛋白酶，細胞再用生理鹽水緩沖液重懸浮。將大約50μL的含鹽細胞懸浮液放于顯微鏡載玻片上，該載玻片經特別設計具有用于存懸浮液的硅室。
然后在一稱之為“直接固化鏡臺”(directional solidification stage)的裝置上對細胞進行冷凍和觀察，用此裝置可進行所有熱學變量的精確控制。該裝置在Rubinsky 1985年7月30日的美國專利第4,531,373號中已有描述，并在此處以參考文獻形式被引用。此裝置由在一普通平面上用平的熱傳導平面相連接的間隙寬度為3mm的一對銅板組成。每塊平板含有一冷凍劑流動通道，一個隔熱器，一個熱電偶，和穿過兩板間隙的顯微鏡光學路徑。將一顯微鏡載玻片橫穿兩熱傳導平面放置，并通過一步進電機將其沿此表面以一恒定的速度移動，穿過此間隙并貫穿顯微鏡光學路徑。該板以冷凍劑和加熱器維持在一預定的溫度，其中一板維持在給定樣品的冷凍溫度以上，另一板則維持在冷凍溫度以下，此安排使得橫穿間隙中產生一線性溫度梯度。將一樣品放在載玻片上，載有樣品的載玻片開始時放于兩板中較暖的那塊板上方。然后通過步進電機使得此載玻片沿著較冷的板的方向移動，從而導致樣品溫度根據樣品相對于兩板的位置而降低。結果是橫穿樣品的溫度梯度、樣品經歷的溫度范圍、冷凍前沿速度和冷凍速率被高精確度地控制。一旦樣品到達低溫板，將樣品在此低溫下保持一規定的時間。然后將載有樣品的載玻片以一控制的速度從冷板移到熱板上以重新加熱。如果用很薄的樣品，此裝置可通過顯微鏡觀察細胞，從而可觀測到這些細胞在冷凍和解凍時發生的變化。
實施例1此實施例描述了在缺乏熱滯后蛋白時癌細胞的冷凍。
本研究中，直接固化鏡臺的高溫板維持在37℃，而低溫板的溫度保持在-5℃至-40℃間。設置(樣品在)兩板間的運動速度以使致冷速度為1℃/min,5℃/min,25℃/min,這些致冷速度是冷凍切除過程中冷凍組織的冷凍前沿位置的典型冷凍速度。一旦樣品達到最低溫度，將它們在此溫度下保持5分鐘，然后迅速返回熱板。進行兩組實驗其中一組的細胞只經過一個冷凍-解凍循環，而另一組細胞則經過兩個相同的冷凍-解凍循環。這樣，每一個實驗條件下至少進行三個實驗。
解凍細胞和不經過冷凍的對照細胞的生活力用錐蟲藍測試和兩色熒光細胞活力測試的方法評定。在錐蟲藍測試中，通過將細胞懸浮液和等體積的0.3％錐蟲藍混合來估測膜的完整性。活細胞數(不被染色)相對于死細胞數(被染色)的比例可由血細胞計數器獲得。以兩色熒光細胞活力測試得到的內源脂活性和質膜完整性為基礎確定活細胞相對于死細胞比例。使用了由分子探針公司(Molecular Probes,Inc.,Eugene,俄勒岡州，美國)提供的試劑盒，該試劑盒含有細胞滲透鈣黃綠素AM及不透膜的Ethidium homodime(EthD-1)。在活細胞中，鈣黃綠素AM經酶促轉化成熒光鈣黃綠素，產生強烈的單色綠色熒光(約530nm)。膜已破壞的細胞被EthD-1標記，在熒光素與核酸結合后，在死細胞中產生一亮紅色熒光(約600nm)，而被活細胞完整的質膜排除。
兩色熒光細胞活性測試是通過重新懸浮冷凍和解凍后的細胞進行的，在Dulbecco磷酸鹽緩沖液中，將100μL的重懸浮細胞與200μL的含有5μL鈣黃綠素AM、10μM EthD-1和低于0.1％DMSO的混合染料混合。混合液于37℃下溫育30分鐘，然后在熒光顯微鏡下研究。利用熒光顯微鏡通過計數隨機選擇的染色細胞的樣品區域中死細胞和活細胞數來確定活細胞相對于死細胞的比率。在錐蟲藍測試和兩色熒光細胞活性測試中，每種隨機選擇的樣品區域的細胞數應超過300個細胞的總數。兩種測試的結果都一致地處于有3％-8％的范圍內。
利用這些方法，ND-1細胞系在各種致冷速度下冷凍到各種最終溫度，然后解凍。然后將關于非冷凍對照的死細胞和正常細胞的百分數以細胞在冷凍速度為1℃/min,5℃/min,25℃/min冷凍時最終溫度的函數繪制曲線。
根據冷凍速度為1℃/min和5℃/min的曲線，表明實驗在最終溫度介于0℃和約-20℃時，隨著最終冷凍溫度的降低細胞死亡數逐漸增加(實驗在1℃/min的速率進行時，細胞死亡數從13％到87％，當實驗在5℃/min的速率下進行時，細胞死亡數從5％到87％)。實驗過程中，當最終溫度低于約-20℃時，細胞破壞的百分數繼續增加，但速度較慢。在1℃/min速率的測試中，終溫達-40℃時，死細胞的平均百分率為95％，而在5℃/min速率的測試中，終溫相同時的死細胞平均百分率為98％。因而兩種致冷速度下，細胞在達-40℃時的冷凍過程中仍沒有完全被破壞。
冷凍速度為25℃/min下進行的測試曲線表明在最終溫度為-5℃和-15℃間，細胞破壞的百分率成級增加，在此溫度范圍，不同實驗中的破壞率的值擴展到一個寬范圍內。這顯示了胞內冷凍是發生于一個窄的溫度范圍內的統計學現象。在冷凍速度為25℃/min的冷凍過程中，細胞的破壞是由于胞內冰晶的形成。因而，在人前列腺腺癌中，從化學破壞向胞內冰晶形成的破壞的過渡可能發生在5℃/min和25℃/min的冷凍速度之間。
實施例2此實施例揭示了熱滯后蛋白存在時癌細胞的冷凍。
準備實施例1中所用的同類型細胞的細胞懸浮液。其中一些懸浮液包括濃度為10mg/mL的分子量為3,600道爾頓的來自于美洲黃蓋鰈(Pleuronectusamericanus)的熱滯后蛋白，其余懸浮液中則不含任何熱滯后蛋白。將懸浮液液滴加到玻璃載玻片上，使厚度約為100μm，用蓋玻片蓋上，在直接固化鏡臺上冷凍。在本實驗中，冷凍過程通過一個放大倍數為40倍的光學顯微鏡記錄于錄像帶上。進行幾組實驗，其中細胞在不同致冷速度(范圍從1℃/min至25℃/min)下冷凍。
在不含熱滯后蛋白的細胞懸浮液中，冷凍過程中形成大的指狀冰晶。這顯示冰形成時的溶質被冰排斥(rejection ofsolutes)。當冷凍過程繼續時，未冷凍細胞被推入指狀冰晶間形成的通道。由于通道中的胞外流質含有高濃度的溶質(來自于被冰晶排斥的溶質)，未冷凍細胞開始失水，以使得胞內和胞外溶液的化學勢達到平衡，最終由于胞內化學破壞作用而導致了該細胞的破壞。
在含有熱滯后蛋白的細胞懸浮液中，冷凍的結果導致了胞外流質中非常細小的微米大小針狀冰晶的形成。這些冰晶逐漸使未冷凍細胞變形，導致這些細胞的細胞膜崩潰。然后冰晶進入細胞內部，使細胞內變成超冷狀。細胞內部驟然冷凍使得在每個細胞中產生許多小的冰晶，導致胞內冰晶呈現為黑的圖像。
推進的冷凍前沿和發生胞內冷凍的部位間的距離小于200μm，發生胞內冷凍的部位的溫度高于-2℃，這是根據沿著直接固化鏡臺的冷凍的線性部位確定的。這些微小的距離和微小的溫度差別說明細胞破壞的程度非常近地符合冷凍程度，并且其發生是獨立于冷凍速率或最終溫度的。
實施例3本實施例描述熱滯后蛋白存在下的前列腺癌組織薄片的冷凍。
人前列腺組織由人前列腺正常和發病部分的針狀活組織獲得。將所研究的組織浸入一種保存溶液(Hank′s平衡鹽水溶液，由西格瑪化學公司(SigmaChemical Company,圣路易斯，密蘇里州，美國)提供，其中加入青霉素G，鏈霉素和慶大霉素。)中，在部分溶液中加入濃度為10mg/mL分子量為3,600道爾頓的來自于美洲黃蓋鰈(Pleuronectus americanus)的熱滯后蛋白，而在其它溶液中則沒有熱滯后蛋白的存在。該組織用切片機切成厚約300μm的薄片，置于一玻璃載玻片上并蓋上一蓋玻片。然后將組織放在直接固化鏡臺上讓它們在與實施例2相同的冷凍速度下冷凍，并通過一光學顯微鏡用錄像帶記錄冷凍過程。
在冷凍和解凍后，利用實施例1中所描述的兩色熒光細胞活力測試確定細胞的活力。在這一系列測試中，冷凍前后的組織薄片均于250μL含有10μm的EthD-1的Dulbecco酸緩沖液中于37℃輕輕振蕩溫育30分鐘。如上面解釋的，此染料在結合到損壞細胞的核酸上后發出紅色熒光。在溫育之后，向混合液中加入SYTOTM-16[一種來自于分子探針公司(MolecularProbes,Inc.,of Eugene,俄勒岡州，美國)的核酸染色液，250μL,10μM],再于37℃輕輕振蕩溫育60分鐘。此后面加入的染液為一種有高滲透能力和核酸高親和力的細胞滲透性染料，在與核酸結合后發出一種非常亮的綠色熒光(約525nm)。EthD-1和SYTO-16間并不干涉對方的結合位點。通過鑒別那些與僅發出綠色熒光的細胞相比較既產生綠色熒光又產生紅色熒光的細胞，人們可以在完整的組織中把活細胞與死細胞區分開。
利用這些步驟，錄像帶顯示浸于熱滯后蛋白溶液中的組織切片中細胞崩潰的方式和在冷凍過程中的發生階段與實施例2中細胞懸浮液中的細胞相同。這種崩潰在任何沒有用熱滯后蛋白處理的組織薄片中都觀測不到。這證明當用熱滯后蛋白處理時懸浮液中的細胞和組織中的細胞具行為上的相似性。
冷凍和解凍后進行的熒光染色測試顯示在熱滯后蛋白存在下的冷凍組織中的細胞已完全被破壞，而那些沒有熱滯后蛋白存在下的冷凍組織中的細胞在所有測試的冷凍條件下只有部分遭到破壞。
上述內容主要是為了描述而提供。顯而易見，對那些本領域中的專業人士來說，本文中描述的操作條件、材料、步驟順序和此過程中其它參數可用各種方式進一步修改或替代，但不會偏離本發明的精神和范圍。
權利要求
1．一種通過破壞含有含水胞內流質的活細胞的不需要的組織進行活機體的治療的方法，包括(a)用一在組織相容溶劑中含有約1mg/mL至約50mg/mL熱滯后蛋白的溶液灌注所說組織；以及(b)利用冷凍探針插入灌注后的組織，并維持足夠長時間，通過使所說細胞中產生針狀冰晶從而致命性破壞所說細胞，如此選擇性冷凍所說組織。
2．一種根據權利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白是具有從南極或北極魚種中分離和純化的熱滯后蛋白的分子結構的一種蛋白質。
3．一種根據權利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白是具有從包括Antarctic notothenioids、北半球海洋鱈類(Nortnen ocean gadoids)、右眼比目魚類、杜父魚類和綿鳚類的組中選出的一個成員中分離和提純的熱滯后蛋白的分子結構的一種蛋白質。
4．一種根據權利要求1的方法，其中所說熱滯后蛋白是從包括下列蛋白質的組中選出的一種熱滯后蛋白(a)從由Pagothenia borchgrevink；Trematomus borchgrevinki；Trematomus bernachii和Dissostichus mawsoni組成的組中選擇的一種中分離和純化出的抗凍糖蛋白；(b)從由美洲黃蓋鰈(Pseudopleuronectus americanus)和銹泥鰈(Limandaferruginea)組成的組中選擇的一種中分離和純化出的Ⅰ-型抗凍多肽；(c)從美絨杜父魚(Hemitripterus americanus)中分離和純化出的Ⅱ-型抗凍多肽；以及(d)從由Macrozoarces americanus,Rhigophila dearborni和南(北)極狼綿鳚(Lycodes polaris)的組中選擇的一種中分離和純化出的Ⅲ-型抗凍多肽組。
5．一種根據權利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白是從包括下列蛋白質的組中選出的一種熱滯后蛋白(a)Dissostichus mawsoni和Trematomus bemachii組中選擇的一種中分離和純化出的抗凍糖蛋白；(b)從美洲黃蓋鰈(Pstudopleuronectus americanus)中分離和純化的Ⅰ-型抗凍多肽；(c)從美絨杜父魚(Hemitripterus americanus)中分離和純化的Ⅱ-型抗凍多肽；(d)從Macrozoarces americanus中分離和純化的Ⅲ-型抗凍多肽。
6．一種根據權利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白是一種從美洲黃蓋鰈(Pseudopleuronectus americanus)中分離和純化的抗凍多肽。
7．一種根據權利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白具有從約2,000道爾頓至約10,000道爾頓的分子量。
8．一種根據權利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白具有從約2,600道爾頓至約6,000道爾頓的分子量。
9．一種根據權利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白具有從約3,000道爾頓至約4,000道爾頓的分子量。
10．一種根據權利要求1的方法，其中所說的溶液含有從約1mg/mL至30mg/mL的熱滯后蛋白。
11．一種根據權利要求1的方法，其中所說的溶液含有從約5mg/mL至15mg/mL的熱滯后蛋白。
12．一種根據權利要求1的方法，其中所說的步驟(b)產生一個由在冷凍組織和非冷凍組織間的運動界面確定的其大小在增長的冷凍區域，所說的方法還包括用成像方法監測所說的界面的位置。
13．一種根據權利要求12的方法，其中所說的成像為超聲成像。
14．一種根據權利要求12的方法，其中所說的成像是磁共振成像。
全文摘要
在致冷冷凍前向細胞內灌注熱滯后蛋白,細胞和組織的低溫切除破壞得以加強。此蛋白的作用是提高了胞內流質中針狀冰晶的生長,該冰晶通過刺穿細胞膜而破壞細胞。此方法降低了冷凍過程中細胞保藏的發生率,從而在低溫切除技術中進行更一致和更可控的不需要組織的破壞。
文檔編號A61P9/00GK1214624SQ97193417
公開日1999年4月21日 申請日期1997年3月26日 優先權日1996年3月29日
發明者鮑里斯·魯賓斯基, 埃米爾－霍馬尤恩·考沙法 申請人:加利福尼亞大學董事會