專利名稱：殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔支架材料的制備方法
技術領域：
本發明屬于材料技術領域，具體涉及一種多孔支架材料的制備方法。
背景技術：
細胞外基質(Extra Cellular Matrix, ECM)在組織再生中起著重要的作用，它不僅具有連接、支持、保水、抗壓及保護等物理學作用，對細胞的基本生命活動也發揮全方位的生物學作用，它影響細胞的存活、生長與死亡，決定細胞的形狀，控制細胞的分化，參與細胞的遷移等等，因此制備支架的主要目標就是在暫時的三維空間中模擬自然ECM的功能， 使支架能夠引導每一個細胞反應，包括細胞黏附、移動、分裂到表型選擇等。組織工程支架材料的選擇和制備是組織工程技術是否運用成功的關鍵。除了考慮材料的化學性質外，材料的物理性質如孔隙率、機械強度、孔之間的連通性以及用于細胞粘附的表面積等也起著重要的作用。組織工程用支架需要較高的孔隙率，且孔徑和支架的結構在組織的培養中也起著關鍵的作用。致孔劑是形成孔徑大小、材料內部結構的決定因素，致孔劑相互粘結，是保證三維支架孔隙相互連通的基礎，也是實現高孔隙率的主要途徑。Murphy等利用NaCl的吸潮性， 預先將作為致孔劑的NaCl粘結、干燥成型，再通過溶液澆注-顆粒浙析技術，制備出孔隙間相互連通、其孔隙間通道的尺寸由粘結條件控制的多孔三維細胞支架，但NaCl吸潮的過程中其粒徑、形態會發生改變，致使所形成的多孔支架孔隙大小不一，形狀不規則。Ma等人利用石蠟軟化融結性質，將石蠟微球粘結成型，澆注聚乳酸的吡啶溶液后，用環(正)己烷浸取石蠟，獲得孔隙形態為球形，孔隙間相互連通、且通道尺寸可控的三維支架。但是，石蠟軟化融結的過程中會破壞石蠟微球的球形結構，致使所形成的支架材料孔隙不規則，需要使用吡啶為溶劑且難以保證石蠟完全從支架中去除。曹誼林等人將粘結劑與離心技術結合， 探索和研究了控制大體積致孔劑粘結程度的新方法(稱為離心粘結技術)，制備出了粘結程度可控、結構均勻的大體積致孔劑粘結塊，并得到內部結構可控的大體積三維細胞支架。 但是粘結劑的大量加入和殘留可能會對支架的性能產生一定的影響。You N. X.以自制射流裝置制備聚己內酯微球，弧形凹槽將微球密堆積，但其需在真空下操作，增加了實驗的難度。Tetsuo A.利用擠壓法對無定形NaCl和蔗糖進行密堆積排列，方法簡單，容易操作，密堆積效果好，但是由于采用NaCl和蔗糖為致孔劑，為了實現致孔劑最大程度的密堆積，需要施加很大的擠壓力，這就會導致部分粒徑均一的致孔劑碎裂，浙濾后所形成的支架材料孔隙不規則，孔徑不均一。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于克服上述制備方法的缺點，提供一種操作簡單， 孔徑均一、孔隙規則、孔隙率高的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法。解決上述技術問題所采用的技術方案是1、溶解殼聚糖和羥基磷灰石
以20g/L的乙酸水溶液為溶劑溶解殼聚糖、羥基磷灰石，殼聚糖與羥基磷灰石的質量比為1 0.05 0.3，攪拌4 8小時，離心去氣泡，得到殼聚糖與羥基磷灰石的混合液。2、制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料以SiO2微球為致孔劑，將SiO2微球加入帶針頭的注射器中，用杵擠壓、夯實SiO2微球，SiO2微球的加入量為注射器容積的0. 125 0. 25，加入步驟1得到的殼聚糖與羥基磷灰石的混合液，混合液的加入量為S^2微球體積的0. 5 1，推動注射器的活塞柄，使混合液流過緊密排列的SiO2微球，將注射器置于真空干燥箱中干燥，從注射器中取出粘結塊，用刀切去粘結塊上、下表面層，將切去上、下表面層的粘結塊置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸2 4小時，用水沖洗至中性，在冰箱中-5 -50°C預凍12 M小時，冷凍干燥，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料。本發明的制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料步驟2中，SiO2微球的粒徑為100 150 μ m。上述的SiA 微球(Spherical 140SL-II-PREP)由日本半井公司(NACALAI TESQUE, INC, KYOTO, TAPAN)生產，再經80目和100目標準篩篩分。本發明的溶解殼聚糖和羥基磷灰石步驟1中，優選殼聚糖與羥基磷灰石的質量比為1 0.1 0.2，最佳選擇殼聚糖與羥基磷灰石按質量比為1 0.2。本發明的制備殼聚糖/羥基磷灰石三維復合多孔支架材料步驟2中，SiO2微球的加入量最佳為注射器容積的0. 25，殼聚糖與羥基磷灰石的混合液的加入量與SiO2微球的體積相同。本發明的制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料步驟2中，最佳將切去上、下表面層的粘結塊置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸3小時。本發明的制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料步驟2中，最佳選擇在冰箱中-20°C預凍M小時。本發明以溶劑澆注-粒子浙濾技術為基礎，結合擠壓法，采用粒徑均一、表面多孔的高純度S^2微球為致孔劑，可通過改變S^2微球的尺寸來調節多孔支架材料的孔隙大小，制備出不同孔徑的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架。與傳統的使用粘結劑將致孔劑密堆積排列的方法相比，本發明方法簡單，操作方便，致孔劑密堆積效果好，制備出的多孔支架無粘結劑殘留，通透性好，孔徑均一，孔隙率最高可達到90. 94%、壓縮強度為 818kPa，遠高于純殼聚糖多孔支架。試驗結果表明，該支架具有良好的體外和體內生物相容性。


圖1是實施例1制備的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔支架的掃描電鏡圖。圖2是實施例2制備的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔支架的掃描電鏡圖。圖3是空白組術后7天肌肉組織HE染色圖。
圖4是空白組術后14天肌肉組織HE染色圖。圖5是空白組術后28天肌肉組織HE染色圖。圖6是試驗組術后7天植入部位臨近肌肉組織HE染色圖。
圖7是試驗組術后14天植入部位臨近肌肉組織HE染色圖。圖8是試驗組術后21天植入部位臨近肌肉組織HE染色圖。圖9是空白組術后7天撕裂肌肉組織的HE染色圖。圖10是空白組術后14天撕裂肌肉組織的HE染色圖。圖11是空白組術后21天撕裂肌肉組織的HE染色圖。圖12是試驗組術后7天植入部位撕裂肌肉組織的HE染色圖。圖13是試驗組術后14天植入部位撕裂肌肉組織的HE染色圖。圖14是試驗組術后21天植入部位撕裂肌肉組織的HE染色圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于這些實施例。實施例11、溶解殼聚糖和羥基磷灰石將Ig殼聚糖(脫乙酰度為80% 95% )、0· Ig羥基磷灰石溶解于IOOmL 20g/L 的乙酸水溶液中，攪拌6小時，離心去氣泡，得到殼聚糖與羥基磷灰石的混合液。2、制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料以SW2微球為致孔劑，將粒徑為100 150 μ m的SW2微球加入20mL帶針頭的注射器中，用杵擠壓、夯實SiO2微球，直至其在注射器中的位置不發生改變為止，SiO2微球的加入量為注射器容積的0. 25，再向注射器中加入殼聚糖與羥基磷灰石的混合液，混合液的加入量與SiA微球的體積相同，推動注射器的活塞柄，使混合液流過緊密排列的SiA微球，將注射器置于真空干燥箱中60°C干燥M小時，從注射器中取出粘結塊，用刀切去粘結塊上、下表面層，將切去上、下表面層的粘結塊置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸3小時， 用水沖洗至中性，在冰箱中-20°C預凍12 M小時，用液氮預凍30分鐘，-50°C冷凍干燥 24小時，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料。所制備的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料采用QUanta200環境掃描電子顯微鏡進行形貌表征，結果見圖1，并按照下述方法測試支架材料的孔隙率和壓縮強度將比重瓶裝滿乙醇稱重巧；將重Ws的樣品浸入乙醇中，真空脫氣，乙醇充盈于多孔支架中，再加滿乙醇稱重W2 ；取出浸滿乙醇的樣品，剩余的乙醇與比重瓶稱重w3。按下式計算支架孔隙率ε ε = Vp/ (Vp+Vs) = (W2-W3-Ws) / (W1-W3)將支架材料制成直徑為12mm、高IOmm的圓柱體試樣，在溫度為25°C，采用動態粘彈譜儀按照GB/T1041-1992，以IN/分鐘的變化速率在1 13N斜坡力的作用下，測其應變為25%的應力值。在測試過程中，試樣在變形小于25%之前斷裂，斷裂強度即為壓縮強度； 試樣在變形25%還沒有斷裂，變形25%時的強度即為壓縮強度。每組取5個樣品，取測試結果的平均值。實驗結果表明，該復合多孔支架的孔是開放的，孔與孔之間連通性較好，孔隙呈規則的圓孔，平均孔徑為125 μ m，孔隙率為90. 94%，壓縮強度為794kPa。實施例2在實施例1的配制殼聚糖/羥基磷灰石混合液步驟1中，將Ig殼聚糖(脫乙酰度為80% 95% )、0. 2g羥基磷灰石溶解于IOOmL 20g/L的乙酸水溶液中，攪拌6小時，離心去氣泡。其他步驟與實施例1相同，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔支架材料。按照試驗1的方法進行形貌表征和孔隙率、壓縮強度測試，實驗結果表明該復合多孔支架的孔是開放的，孔與孔之間連通性較好，平均孔徑為117 μ m(見圖2)，孔隙率為 91. 97%，壓縮強度為818kPa。實施例3本實施例的溶解殼聚糖和羥基磷灰石步驟1中，將Ig殼聚糖(脫乙酰度為80 % 95% )、0. 05g羥基磷灰石溶解于IOOmL 20g/L的乙酸水溶液中，攪拌4小時，離心去氣泡。 其他步驟與實施例1相同，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔支架材料。實施例4本實施例的溶解殼聚糖和羥基磷灰石步驟1中，將Ig殼聚糖(脫乙酰度為80 % 95% )、0. 3g羥基磷灰石溶解于IOOmL 20g/L的乙酸水溶液中，攪拌8小時，離心去氣泡。其他步驟與實施例1相同，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔支架材料。實施例5在實施例1 4的制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料步驟2中，將粒徑為100 150 μ m的SiA微球加入20mL帶針頭的注射器中，用杵擠壓、夯實SW2微球， 直至其在注射器中的位置不發生改變為止，SiO2微球的加入量為注射器容積的0. 125，該步驟的其他步驟與實施例1相同。其他步驟與相應實施例相同，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料。實施例6在實施例1 4的制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料步驟2中，將粒徑為100 150 μ m的SiA微球加入20mL帶針頭的注射器中，用杵擠壓、夯實SW2微球， 直至其在注射器中的位置不發生改變為止，SiO2微球的加入量為注射器容積的0. 2，該步驟的其他步驟與實施例1相同。其他步驟與相應實施例相同，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料。實施例7在實施例1 6的制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料步驟2中，向注射器中加入殼聚糖與羥基磷灰石的混合液，混合液的加入量為SiO2微球體積的0. 5，該步驟的其他步驟與相應實施例相同。其他步驟與相應實施例相同，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料。實施例8在實施例1 6的制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料步驟2中，向注射器中加入殼聚糖與羥基磷灰石的混合液，混合液的加入量為S^2微球體積的0. 75，該步驟的其他步驟與相應實施例相同。其他步驟與相應實施例相同，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料。實施例9在實施例1 8的制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料步驟2中，將切去上、下表面層的粘結塊置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸2小時，用水沖洗至中性， 在冰箱中_5°C預凍M小時，用液氮預凍30分鐘，_50°C冷凍干燥M小時，該步驟的其他步驟與相應實施例相同。其他步驟與相應實施例相同，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料。實施例10在實施例1 8的制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料步驟2中，將切去上、下表面層的粘結塊置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸4小時，用水沖洗至中性， 在冰箱中_50°C預凍12小時，用液氮預凍30分鐘，-50°C冷凍干燥M小時，該步驟的其他步驟與相應實施例相同。其他步驟與相應實施例相同，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料。為了證明本發明的有益效果，發明人對本發明實施例1和實施例2制備的殼聚糖 /羥基磷灰石三維多孔支架材料進行了各種實驗室研究試驗，各種試驗情況如下實驗材料第3代骨肉瘤細胞購于中國典型培養物保藏中心(武漢)；健康雄性 SD大鼠，體重200 220g，購于西安交通大學醫學院實驗動物中心(西安)；Dulbecco’ s Modified Eagle Medium(DMEM)細胞培養液、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲亞砜，購于美國 Sigma-Aldrich公司；白細胞介素1 β試劑盒、白細胞介素6試劑盒、白細胞介素10試劑盒、 腫瘤壞死因子TNF-α試劑盒，由美國R&D公司生產。實驗儀器=Zenyth 3100酶標儀，由奧地利Anthos公司生產；Q800DMA動態粘彈譜儀、由美國TA公司生產；RM2U6組織切片機由德國LEICA公司生產。1、多孔支架的體外活性實驗將直徑為14mm、厚度為2mm的截面片狀支架用6tlCo輻照消毒后，用含10%胎牛血清的DMEM培養液浸濕，然后置于M孔板內，每孔1片支架；將第3代骨肉瘤細胞加入含 10%胎牛血清的DMEM培養液中，得到細胞濃度為3X IO8個/L的細胞懸液，每片支架上均勻滴加100 μ L細胞懸液，靜置4小時后再沿孔壁緩慢加入含10%胎牛血清的DMEM培養液， 每孔加1. 5mL ；將M孔板置于37°C、5% C02、95%相對濕度的(X)2培養箱中培養。實驗分為受試材料組、陰性對照組(空白組)、陽性對照組(含0. 64%苯酚的DMEM 培養液)。將受試材料組(實施例1制備的殼聚糖/羥基磷灰石多孔支架材料)分別在(X)2 培養箱中培養M、48、72小時(分別做三組平行實驗)，吸棄培養基，用PBS緩沖溶液清洗受試材料3次，置于新的培養板中，每孔1片支架，每孔加入ImL DMEM細胞培養液和40 μ L 5mg/mL的MTT水溶液，37°C孵育4小時，吸棄上清液，每孔加入420 μ L 二甲基亞砜，振蕩10 分鐘，每孔吸取150 μ L至96孔板，用酶聯免疫檢測儀檢測其在490nm波長處的吸光度值 OD (測得的吸光度值OD與細胞增殖數成正比)，每個時間點每組平行測定5孔計算均數和標準差。按下式計算相對增殖率RGR并評價材料的細胞毒性RGR = 0Dtest/0Dcontast X 100%式中RGR為細胞毒性實驗相對增殖率(％ ) ；ODtest為試驗組吸光值；0D。。ntast為陰性對照組吸光值。表1是不同的RGR所對應的細胞毒性等級。表1相對增值率與細胞毒性分級的關系
權利要求
1.一種殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法，其特征在于由下述步驟組成(1)溶解殼聚糖和羥基磷灰石以20g/L的乙酸水溶液為溶劑溶解殼聚糖、羥基磷灰石，殼聚糖與羥基磷灰石的質量比為1 0.05 0.3，攪拌4 8小時，離心去氣泡，得到殼聚糖與羥基磷灰石的混合液；(2)制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料以SiO2微球為致孔劑，將S^2微球加入帶針頭的注射器中，用杵擠壓、夯實S^2微球， SiO2微球的加入量為注射器容積的0. 125 0. 25，加入步驟(1)得到的殼聚糖與羥基磷灰石的混合液，混合液的加入量為SiO2微球體積的0. 5 1，推動注射器的活塞柄，使混合液流過緊密排列的SiO2微球，將注射器置于真空干燥箱中干燥，從注射器中取出粘結塊，用刀切去粘結塊上、下表面層，將切去上、下表面層的粘結塊置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸2 4小時，用水沖洗至中性，在冰箱中-5 -50°C預凍12 M小時，冷凍干燥，制備成殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料。
2.根據權利要求1所述的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法，其特征在于所述的SW2微球的粒徑為100 150 μ m。
3.根據權利要求1所述的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法， 其特征在于在溶解殼聚糖和羥基磷灰石步驟(1)中，殼聚糖與羥基磷灰石的質量比為 1 0. 1 0. 2。
4.根據權利要求1所述的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法， 其特征在于在溶解殼聚糖和羥基磷灰石步驟(1)中，殼聚糖與羥基磷灰石按質量比為 1 0. 2。
5.根據權利要求1所述的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法，其特征在于在制備殼聚糖/羥基磷灰石三維復合多孔支架材料步驟( 中，SiO2微球的加入量為注射器容積的0. 25，殼聚糖與羥基磷灰石的混合液的加入量與SiA微球的體積相同。
6.根據權利要求1所述的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法，其特征在于在制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料步驟O)中，將切去上、下表面層的粘結塊置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸3小時。
7.根據權利要求1所述的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法，其特征在于在制備殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料步驟( 中，所述的預凍是在冰箱中-20°C預凍M小時。
全文摘要
一種殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法，以溶劑澆注-粒子瀝濾技術為基礎，結合擠壓法，采用粒徑均一、表面多孔的高純度SiO2微球為致孔劑，可通過改變SiO2微球的尺寸來調節多孔支架材料的孔隙大小，制備出不同孔徑的殼聚糖/羥基磷灰石三維多孔復合支架。與傳統的使用粘結劑將致孔劑密堆積排列的方法相比，本發明方法簡單，操作方便，致孔劑密堆積效果好，制備出的多孔支架無粘結劑殘留，通透性好，孔徑均一，孔隙率和壓縮強度高于純殼聚糖多孔支架。試驗結果表明，該支架具有良好的體外和體內生物相容性。
文檔編號A61L27/20GK102266590SQ20111019955
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月15日 優先權日2011年7月15日
發明者張志琪, 牟朝麗, 王金磊, 祁小妮 申請人:陜西師范大學