專利名稱：叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法
技術領域：
本發明涉及一種表面消毒方法，具體是一種叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法， 屬于微生物培養領域。
背景技術：
叢枝菌根真菌(AMF)是一類不能純培養的植物共生菌，在對AMF非共生階段及生理生化的研究中往往需要對其孢子進行表面消毒以排除其他微生物的干擾。由于AMF的孢子具有貼壁的特性，在一般的器具中它們往往貼伏在器壁上，很難使其完全浸沒在消毒液中，從而不能很好的消毒。目前最為常用的AMF孢子表面消毒方法有“Kitasato beaker”法和“Eppendorf surface sterilized”法。"Kitasato beaker”法由英國禾斗學家 Mosse 在《Transactions of the British Mycological Society)) 1959 年 42 :273-286 “Theregular germination of resting spores and some observations on the growthrequirements of an Endogone sp.causing vesicular-arbuscular mycorrhiza"中提出，是一種基于抽濾系統進行消毒的方法，通過不斷添加消毒液使孢子始終浸在消毒液中來達到孢子表面消毒的目的，該方法雖具有較好的消毒效果，但其操作復雜且需要專門儀器的輔助，如真空泵和專門的無菌罩，另外該方法操作區域較大會損失大量孢子；"Eppendorf surface sterilized”法由西 Ι 31 禾Cano 《Mycorrhiza》2008 $ V :627_654 “In vitro culturesopen new prospects for basic research in arbuscular mycorrhizas，，中提出，是一禾中通過離來實現孢子表面消毒的方法，該方法是將孢子轉移到裝有消毒液的Eppendorf管中，通過離心在離心力的作用下使孢子浸沒在消毒液中實現表面消毒的，這種消毒方法需要離心機的輔助，雖然在一定程度上能實現AMF孢子的表面消毒，但由于操作比較劇烈，表面消毒后孢子的活力會降低。

發明內容
本發明為實現AMF孢子的表面消毒，使消毒過程不致造成孢子的損失同時又不影響孢子的活力，公開了一種AMF孢子的表面消毒方法。本發明是通過以下技術方法實現的a.取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入其中一個培養皿內，裁剪一些吸水紙放入其它幾個培養皿內，另留二個空培養皿不放濾紙與吸水紙，將培養皿包嚴，備用蒸餾水，對培養皿和蒸餾水進行高壓蒸汽滅菌；b.配制含有氯胺T、氯霉素、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素和吐溫-20共5種試劑的孢子表面消毒液，將消毒液通過微孔濾膜過濾除菌；c.打開裝有雙層濾紙的培養皿，將載有AMF孢子的濾紙片放入培養皿內的雙層濾紙中間，用膠頭滴管吸取消毒液滴加在上層濾紙上，使整個雙層濾紙浸透并在上層可見消毒液，將培養皿封蓋；
d.消毒過程中如需更換消毒液，可通過轉移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養皿內吸取消毒液，再轉至另一套空培養皿中重新添加消毒液；e.在消毒完成后，將雙層濾紙轉移到裝有吸水紙的培養皿中，用吸水紙吸取雙層濾紙所吸附的消毒液；f.轉移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養皿中，用膠頭滴管在上層濾紙中添加無菌水，利用吸水紙吸取水分，重復操作3-5次；g.取出上層濾紙并倒置放入另一培養皿中，解剖鏡下分別檢查并轉移上層濾紙、 下層濾紙和濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。本發明通過雙層濾紙和培養皿的組合實現了對AMF孢子的表面消毒。該方法操作簡單溫和、消毒液用量少，消毒前后不會丟失孢子，也不影響孢子的活力，同時消毒過程中也不需要其他儀器的輔助。


附圖1是本發明AMF孢子表面消毒示意圖。附圖2是本發明表面消毒后用無菌水清洗AMF孢子的示意圖。附圖標記為膠頭滴管1，消毒液2，上層濾紙3，孢子4，濾紙片5，培養皿6，下層濾紙7，無菌水8，吸水紙9。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明做進一步詳細描述a.備用10套60mm的玻璃培養皿、直徑為75mm的普通濾紙和吸水紙，取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入培養皿底，其上折的邊緣與培養皿壁留有空隙以便轉移，裁剪一些吸水紙，大小剛好放入培養皿底，4張一組放入培養皿內，共放置7套培養皿，另留二套空培養皿以備轉移雙層濾紙，將培養皿包嚴，備用200ml蒸餾水和2支膠頭滴管，對培養皿、蒸餾水和膠頭滴管在121°C下高壓蒸汽滅菌20min ；b.配制含有50g/L氯胺T、50mg/L氯霉素、100mg/L硫酸慶大霉素、200mg/L硫酸鏈霉素和0. 05 %吐溫-20的孢子表面消毒液20mL，將消毒液通過0. 22 μ m ？L徑的微孔濾膜過濾除菌；c.整個孢子表面消毒過程在室溫條件下，放置于超凈工作臺上進行，打開裝有雙層濾紙的培養皿，將載有孢子的濾紙片放入培養皿內的兩層濾紙正中，用膠頭滴管吸取消毒液從一側開始滴加在雙層濾紙的上層濾紙上，使整個雙層濾紙浸透并在上層可見消毒液，封蓋培養皿，消毒液滴加過程中避免產生氣泡；d.消毒過程中如需更換消毒液，可通過轉移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養皿內吸走消毒液，再轉至另一套空培養皿中重新添加消毒液來實現；e.消毒時間為15min，消毒完成后，將雙層濾紙轉移到裝有吸水紙的培養皿中，用吸水紙吸取濾紙吸附的消毒液；f.轉移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養皿中，用另一個膠頭滴管在上層濾紙表面添加無菌水，利用吸水紙從下層濾紙吸收水分，重復操作5次；&取出上層濾紙并倒置放入另一套培養皿內，解剖鏡下分別檢查并轉移上層濾紙、下層濾紙及濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。
權利要求
1.叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法，其特征在于是通過以下技術方法實現的 1. a.取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入其中一個培養皿內，裁剪一些吸水紙放入其它幾個培養皿內，另留二個空培養皿不放濾紙與吸水紙，將培養皿包嚴，備用蒸餾水，對培養皿和蒸餾水進行高壓蒸汽滅菌；1. b.配制含有氯胺T、氯霉素、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素和吐溫-20共5種試劑的孢子表面消毒液，將消毒液通過微孔濾膜過濾除菌；1. c.打開裝有雙層濾紙的培養皿，將載有AMF孢子的濾紙片放入培養皿內的雙層濾紙中間，用膠頭滴管吸取消毒液滴加在上層濾紙上，使整個雙層濾紙浸透并在上層可見消毒液，將培養皿封蓋；1. d.消毒過程中如需更換消毒液，可通過轉移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養皿內吸取消毒液，再轉至另一套空培養皿中重新添加消毒液；1. e.在消毒完成后，將雙層濾紙轉移到裝有吸水紙的培養皿中，用吸水紙吸取雙層濾紙所吸附的消毒液；1. f.轉移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養皿中，用膠頭滴管在上層濾紙中添加無菌水，利用吸水紙吸取水分，重復操作3-5次；1.g.取出上層濾紙并倒置放入另一培養皿中，解剖鏡下分別檢查并轉移上層濾紙、下層濾紙和濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。
2.根據權利要求1所述的叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法，其特征在于是通過以下技術方法實現的2. a.備用10套60mm的玻璃培養皿、直徑為75mm的普通濾紙和吸水紙，取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入培養皿底，其上折的邊緣與培養皿壁留有空隙以便轉移，裁剪一些吸水紙，大小剛好放入培養皿底，4張一組放入培養皿內，共放置7套培養皿，另留二套空培養皿以備轉移雙層濾紙，將培養皿包嚴，備用200ml蒸餾水和2支膠頭滴管，對培養皿、蒸餾水和膠頭滴管在121°C下高壓蒸汽滅菌20min ；2. b.配制含有50g/L氯胺T、50mg/L氯霉素、100mg/L硫酸慶大霉素、200mg/L硫酸鏈霉素和0. 05 %吐溫-20的孢子表面消毒液20mL，將消毒液通過0. 22 μ m孔徑的微孔濾膜過濾除菌；2. c.整個孢子表面消毒過程在室溫條件下，放置于超凈工作臺上進行，打開裝有雙層濾紙的培養皿，將載有孢子的濾紙片放入培養皿內的兩層濾紙正中，用膠頭滴管吸取消毒液從一側開始滴加在雙層濾紙的上層濾紙上，使整個雙層濾紙浸透并在上層可見消毒液， 封蓋培養皿，消毒液滴加過程中避免產生氣泡；2. d.消毒過程中如需更換消毒液，可通過轉移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養皿內吸走消毒液，再轉至另一套空培養皿中重新添加消毒液來實現；2. e.消毒時間為15min，消毒完成后，將雙層濾紙轉移到裝有吸水紙的培養皿中，用吸水紙吸取濾紙吸附的消毒液；2. f.轉移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養皿中，用另一個膠頭滴管在上層濾紙表面添加無菌水，利用吸水紙從下層濾紙吸收水分，重復操作5次；2. g.取出上層濾紙并倒置放入另一套培養皿內，解剖鏡下分別檢查并轉移上層濾紙、 下層濾紙及濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。
全文摘要
本發明公開了一種叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法，其技術方案是將濾紙與吸水紙分別放入幾個培養皿內，配制孢子表面消毒液，將載有AMF孢子的濾紙片放入培養皿內的雙層濾紙中間，吸取消毒液滴加在上層濾紙上，將雙層濾紙轉移到裝有吸水紙的培養皿中，用吸水紙吸取所吸附的消毒液，取出上層濾紙并倒置放入另一培養皿中，轉移濾紙上的AMF孢子，完成表面消毒。本發明通過雙層濾紙和培養皿的組合實現了對AMF孢子的表面消毒。該方法操作簡單溫和，消毒液用量少，消毒前后不會丟失孢子，也不影響孢子的活力，同時也不需要其他儀器的輔助。
文檔編號A61L101/32GK102166367SQ20101061713
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者唐明, 孫學廣, 陳輝 申請人:西北農林科技大學