專利名稱：一種多價免疫刺激納米制劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，尤其涉及一種多價免疫刺激納米制劑及其制備方法和應用。
背景技術：
CpG DNA是ー類具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序為核心的DNA序列，它包括含CpG基序的人工合成的寡聚脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,此時簡稱為CpG0DN)和自然界中細菌、病毒、無脊椎動物等低等生物的基因組DNA。其中，CpG基序(CpGmotifs)是指ー類以非甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤核苷酸為核心的寡聚脫氧核糖核苷酸。CpG DNA是首先在卡介苗(BCG)提取液中發現的，它可以刺激多種免疫細胞的活化或増殖，產生多種細胞因子，具有強烈的免疫激活功能。CpGDNA在細菌、病毒基因組中的出現頻率遠高于在脊椎動物中的出現頻率，相應地，脊椎動物的80%胞嘧啶的第五位碳原子是甲基化的。這種顯著的差異使脊椎動物可以識別入侵的細菌及病毒，CpG基序成為人等哺乳動物免疫刺激信號的基礎。人工合成的含有CpG基序的DNA序列(CpG 0DN)可以完全模仿細菌DNA的刺激性作用，具有激活多種免疫細胞，誘生多種細胞因子的作用，尤其可用于調節例如免疫應答向Thl型轉換等免疫學效應。另外，CpG ODN可作為具有治療性作用的DNA，在抗感染免疫、癌癥治療、過敏性疾病以及免疫佐劑等領域具有巨大的潛在應用前景。但是,未經過修飾的CpG ODN易降解、攝取率低、需要高劑量重復給藥,極大地限制了它在醫學領域的應用?，F有的應用于臨床實驗的CpG ODN主要是DNA骨架經過硫代修飾的硫代磷酸酯骨架，簡稱為S-CpG ODN0研究表明，通過硫代方法修飾的CpG ODN藥物存在明顯的毒副作用，重復注射高劑量硫代CpG ODN會引發機體急性毒性，引起劑量依賴性脾腫大、導致腎損傷并造成其它與過度激活免疫相關的毒性表現甚至死亡。在此基礎上，申請人利用巰基修飾CpG 0DN,從而將CpG ODN偶聯到納米金粒子表面，穩定地形成自組裝納米結構載體，此時，該自組裝結構又被稱為CpG ODN-SH-納米金復合物。該CpG ODN-SH-納米金復合物具有很低的細胞毒性并在細胞內具有很好的穩定性，另外，該CpG ODN-SH-納米金復合物還具有良好的生物相容性和高效載運特性。該工作已發表在暑名期干1J Angew. Chem.1nt. Ecl.上(Polyvalent Immunostimulatory Nanoagentswitn Self-Assembled CpG Oligonucleotide-Conjugated Gold Nanoparticles. MinWei, Nan Chen，Jiang Li，Min Yin, Le Liang, Yao He, Haiyun Song, Chunhai Fan, and QingHuang, Angew. Chem.1nt. Ed2012，51，5 :1202-1206)。但是，申請人發現，對 CpG ODN 進行巰 基修飾需要耗費大量的成本，而且，所形成的CpG ODN-SH-納米金復合物在低劑量下的免疫刺激效果非常有限
發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的未經修飾的CpG ODN易降解、攝取率低和需要高劑量重復給藥，而修飾的CpG ODN具有各種副作用以及低劑量下免疫刺激效果低等問題。本發明提供一種多價免疫刺激納米制劑的制備方法，包括(I)提供納米金水溶液；(2)利用多聚腺苷酸修飾CpG ODN的3’端得到CpG ODN-polyA ;以及(3)將所述CpGODN-polyA組裝到所述納米金上形成所述多價免疫刺激納米制劑。該制備方法簡便快速、原料易得、成本較低且可重復性高。在所述步驟(I)中，通過檸檬酸三鈉水溶液還原氯金酸得到所述納米金水溶液。 該還原方法操作簡便，エ藝成熟。雖然在實施例中僅給出了 15nm的納米金水溶液的制備步驟，但是通過調節反應的條件，本領域的技術人員可以根據實際得到各種粒徑的納米金。所述步驟(3)進ー步包括(3.1)將所述納米金水溶液和所述CpG ODN-polyA混合均勻并震蕩反應；(3. 2)分批加入磷酸鹽緩沖液，分離得到所述多價免疫刺激納米制劑。磷酸鹽緩沖液采用分批加入的原因是可以防止由于鹽濃度的驟然增高而導致的納米金的聚集，從而使得CpG ODN-polyA更為有效地結合到納米金表面。在所述步驟(3.1)之前，步驟(3)進ー步包括濃縮所述納米金水溶液。實驗證明，高濃度的納米金水溶液更有利于組裝到所述CpG ODN-polyA表面。通過上述濃縮步驟,所述納米金與所述CpG ODN-polyA的終濃度優選比值為IOnM 3 u M。應該理解，雖然實施例中僅給出了該具體的比例值，但是，其他終濃度比例的納米金和CpG ODN-polyA同樣能夠發生結合，只要CpG ODN序列上存在多聚腺苷酸polyA即可。在所述步驟(3. 2)中，所述分離操作包括利用磷酸鹽緩沖液進行洗滌和重懸。該具體的分離操作主要用于洗滌除去沒有組裝到納米金表面的CpG ODN-polyA，消除其它干擾因素。所述CpG ODN-polyA 的序列選自 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 3。所述CpG ODN-polyA在其5’端進行FAM標記或Cy5標記。本發明提供ー種上述制備方法所獲得的多價免疫刺激納米制劑，所述多價免疫刺激納米制劑為polyA tailed CpG ODN-納米金復合物。該polyA tailed CpG ODN-納米金復合物的免疫刺激活性及材料穩定性與傳統的巰基修飾的CpG-納米金復合物相當，但價格更為低廉。本發明還提供ー種上述多價免疫刺激納米制劑在免疫刺激上的應用。所述polyA tailed CpG 0DN-納米金復合物的濃度為5_25nM。通過透射電子顯微鏡TEM觀察polyA tailed CpG ODN-納米金復合物進入細胞后在細胞內的位置，以及通過氯喹抑制其受體TLR-9確定復合物的細胞通路。結果表明，本發明的多價免疫刺激納米制劑進入細胞后主要位于內吞小體內，且該多價免疫刺激納米制劑與傳統CpG DNA細胞通路一致，均是通過其受體TLR-9起作用的。本發明提供的polyAtailed CpG ODN-納米金復合物分別刺激RAW264. 7細胞8h、24h，取細胞培養上清進行細胞因子TNF-a (8h)、IL-6/IL-12 (24h)的ELISA檢測。結果表明，本發明的多價免疫刺激納米制劑可以顯著提高細胞水平的免疫刺激活性，活性的提高在低濃度時尤為明顯。通過將本發明提供的polyA tailed CpG ODN-納米金復合物通過尾靜脈注射到小鼠體內，3h后取血清進行ELISA檢測。結果表明，與傳統未經修飾的CpG DNA相比，本發明的多價免疫刺激納米制劑可以提高CpG的體內免疫刺激活性。
總之，本發明提供的多價免疫刺激納米制劑與傳統的CpG ODN相比，具有很高的穩定性，對細胞活力沒有影響，細胞攝取率高，給藥劑量低，免疫刺激活性好，在低劑量時效果尤為關出。


圖1A是通過透射電子顯微鏡TEM表征所獲得的納米金的照片；圖1B是通過透射電子顯微鏡TEM表征所獲得的根據本發明的納米金復合物的照片;圖2是通過熒光分光光度計所獲得的CpG ODN濃度的數據分析圖，其中，橫坐標CpG-SH 表示 CpG ODN -SH ;CpG_A5 表示 CpG 0DN-polyA5 ；CpG-A 10 表示 CpG ODN-polyA 10 ；CpG-A 15表示CpG ODN-polyA 15 ;縱坐標表示姆個納米金粒子表面的CpG ODN的條數；圖3A是通過動態光散射粒子分析儀所獲得的CpG ODN-SH與納米金組裝形成的復合物對應的譜圖；圖3B是通過動態光散射粒子分析儀所獲得的CpG 0DN-polyA5與納米金組裝形成的復合物對應的譜圖；圖3C是通過動態光散射粒子分析儀所獲得的CpG ODN-poIyA 10與納米金組裝形成的復合物對應的譜圖；圖3D是通過動態光散射粒子分析儀所獲得的CpG ODN-poIyA15與納米金組裝形成的復合物對應的譜圖；圖4是通過噻唑藍(MTT)細胞活力檢測方法所獲得的polyA tailed CpG ODN-納米金復合物細胞活力的數據分析圖，其中，CpG-A5-AuNPs表示polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物；CpG-A15_AuNPs表示polyA15tailed CpG ODN-納米金復合物；橫坐標表示復合物的濃度；縱坐標表示細胞活力；圖5是通過流式細胞儀檢測所獲得的納米金復合物的細胞攝取圖，其中，空白對照組表示的是序列為 Cy5-CpG-poly A5，其序列為 SEQ ID NO. 9 Cy5-TCCATGACGTTCCTGACGTTTTTTTAAAAA ；Cy5-CpG-A5-AuNPs 表示 Cy5 修飾的 polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物；圖6A是細胞攝取Cy5-ssCpG ODN的細胞亮場視野圖；圖6B是細胞攝取Cy5-CpG-A5-AuNPs的細胞亮場視野圖；圖6C是細胞攝取Cy5-ssCpG ODN的細胞熒光圖片，單鏈ODN由于難以進入細胞，所以沒有觀察到熒光；圖6D是細胞攝取Cy5-CpG-A5_AuNPs的細胞的熒光圖片，可見Cy5-CpG-A5_AuNPs大量攝取；圖7A表示polyA15tailed CpG ODN-納米金復合物與硫代CpG在不同溶度下的TNF-a細胞因子分泌水平對比，其中，S-CpG表示硫代CpG 0DN,其指的是CpG 0DN1826對應的硫代磷酸酯骨架；CpG-A15-AuNPs表示polyA15tailed CpG ODN-納米金復合物；圖7B表不polyA15tailed CpG 0DN-納米金復合物、CpG 0DN-SH-納米金復合物、硫代CpG在不同溶度下的TNF-a細胞因子分泌水平對比，其中，S-CpG ODN表示CpG 0DN1826對應的硫代磷酸酯骨架；CpG-SH-AuNPs表示CpG ODN-SH-納米金復合物；CpG-A15_AuNPs表7]\ polyA15tailed CpG 0DN-納米金復合物；
圖7C表不polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物、polyAlOtailed CpG ODN-納米金復合物、polyA15tailed CpG ODN-納米金復合物在不同溶度下的IL-6細胞因子分泌水平對比，其中，CpG-A5-AuNPs 表示 polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物；CpG_A10_AuNPs表不 polyAlOtailed CpG ODN-納米金復合物；CpG_A15_AuNPs 表不 polyA15tailed CpGODN-納米金復合物；圖7D表不polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物、polyAlOtailed CpG 0DN-納米金復合物、polyA15tailed CpG ODN-納米金復合物在不同溶度下的IL-12細胞因子分泌水平對比，其中，CpG-A5-AuNPs 表示 polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物；CpG_A10_AuNPs表不 polyAlOtailed CpG 0DN-納米金復合物；CpG_A15_AuNPs 表不 polyA15tailed CpGODN-納米金復合物；圖8A表示磷酸緩沖液、納米金、指3’端修飾有5個腺苷酸的非CpG 0DN、單鏈CpG 0DN、polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物、CpG 0DN-SH-納米金復合 物、硫代CpGODN的IL-12細胞因子分泌水平對比，其中，PBS表示磷酸緩沖液；AuNPs表示納米金；Non-CpG-A5-Au表示3’端修飾有5個腺苷酸的非CpG ODN ；ssCpG ODN表示單鏈CpG ODN ；CpG_A5_Au 表不 polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物；CpG_SH_Au 表不 CpG ODN-SH-納米金復合物；S-CpG ODN表示硫代CpG ODN ；圖8B表示磷酸緩沖液、納米金、指3’端修飾有5個腺苷酸的非CpG 0DN、單鏈CpG 0DN、polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物、CpG 0DN-SH-納米金復合物、硫代CpGODN的MCP-1細胞因子分泌水平對比，其中，PBS表示磷酸緩沖液；AuNPs表示納米金；Non-CpG-A5-AuNPs表示3’端修飾有5個腺苷酸的非CpG ODN ；ssCpG ODN表示單鏈CpGODN ;CpG-A5-AuNPs 表示 polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物；CpG_ (SH)-AuNPs 表示 CpGODN-SH-納米金復合物；S-CpG ODN表示硫代CpG ODN0
具體實施例方式下面結合附圖，給出本發明的較佳實施例，并予以詳細描述，使能更好地理解本發明的功能、特點。在本文中，CpG DNA是指ー類具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序為核心的DNA序列。CpG ODN是指ー類含CpG基序的人工合成的寡聚脫氧核苷酸。CpG ODN-SH是指3’端修飾有巰基的CpG ODN0CpG ODN-SH-納米金復合物是指CpG 0DN-SH與納米金組裝形成的復合物。CpG ODN-polyA是指ー類3’端修飾有多聚腺苷酸的CpG ODN0其中，CpGODN-po I yA5是指3’端修飾有5個腺苷酸的CpG ODN0 CpG ODN-po IyA 10是指3’端修飾有10個腺苷酸的CpG ODN0 CpG ODN-poIyA15是指3’端修飾有15個腺苷酸的CpG ODN0CpG ODN-polyA-納米金復合物是指CpG ODN-polyA與納米金組裝形成的復合物，同時也被稱為polyAtailed CpG ODN-納米金復合物。其中,polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物是指CpG 0DN-polyA5與納米金組裝形成的復合物。polyAlOtailed CpG ODN-納米金復合物是指CpG 0DN-polyA10與納米金組裝形成的復合物。polyA15tailed CpG ODN-納米金復合物是指CpG ODN-poIyA15與納米金組裝形成的復合物。
FAM-CpG ODN是指ー類5’端修飾有熒光基團FAM的CpG ODN0FAM-CpG ODN-polyA是指ー類5’端修飾有熒光基團FAM，3’端修飾有多聚腺苷酸的CpG ODN0其中，FAM-CpG ODN-po I yA5是指5’端修飾有熒光基團FAM，3’端修飾有5個腺苷酸的CpG ODN0 FAM-CpG ODN-poIyA 10是指5’端修飾有熒光基團FAM，3’端修飾有10個腺苷酸的CpG ODN0 FAM-CpG 0DN_polyA15是指5’端修飾有熒光基團FAM，3’端修飾有15個腺苷酸的CpG ODN。Cy5-CpG ODN-polyA是指ー類5’端修飾有熒光基團Cy5，3’端修飾有多聚腺苷酸的CpG ODN0其中，Cy5-CpG ODN-po I yA5是指5’端修飾有熒光基團Cy5，3’端修飾有5個腺苷酸的CpG ODN0 Cy5-CpG ODN-poIyA 10是指5’端修飾有熒光基團Cy5，3’端修飾有10個腺苷酸的CpG ODN0 Cy5-CpG 0DN_polyA15是指5’端修飾有熒光基團Cy5，3’端修飾有15個腺苷酸的CpG ODN。實施例1納米金的制備 試劑包括氯金酸購自阿拉丁公司，分析純的檸檬酸三鈉購自國藥化學試劑有限公司。制備過程包括以下幾個步驟(I)取1%氯金酸HAuCl4溶液Iml和99ml的Mill1-Q水倒入干凈的蒸餾瓶內，制成0. 01%HAuC14工作溶液，加入攪拌子，置于磁力攪拌加熱器上加熱并攪拌；(2)待溶液完全沸騰后，將轉速調至30，并一次性快速加入3. 5ml新鮮配制的10mg/ml檸檬酸三鈉水溶液；(3)保持溶液沸騰且快速攪拌20min，停止加熱，繼續攪拌，冷卻；(4)老化過夜,用0. 22 ii m濾膜過濾,得到粒徑基本均一的15nm的納米金水溶液，
4°C保存。應該理解，上述提供的納米金的制備方法是已知的，通過調節反應的條件，本領域的技術人員可以根據實際需要調節最終的所獲得的納米金的粒徑。同樣，除了上述通過檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法來獲得納米金之外，其他任何合適的能夠得到納米金的方法均在本發明的保護范圍之內。實施例2納米金復合物的制備及表征試劑包括HPLC純化的CpG ODN合成自Invitrogen公司，分析純的氯化鈉、磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鈉購自國藥化學試劑有限公司。制備過程包括以下幾個步驟(I)取Iml納米金12000rpm4°C離心20min,棄去800 y I上清,沉淀重懸即得濃縮5倍的納米金溶液。(2)取Iml濃縮5倍的納米金于1. 5mL離心管中至終濃度10nM，加入100 u M CpGODN至終濃度3 ii M，輕輕吹打混合均勻，25°C 400rpm震蕩過夜。其中，該CpG ODN 是 CpG ODN-poIyA5 (其序列為 SEQ ID NO.1 TCCATGACGTTCCTGACGTTTTTTTAAAAA)、CpG ODN-poIyA 10 (其序列為 SEQ ID NO. 2 TCCATGACGTTCCTGACGTTTTTTTAAAAAAAAAA)或 CpG ODN-poIyA15 (其序列為 SEQ ID NO. 3 TCCATGACGTTCCTGACGTTTTT TTAAAAAAAAAAAAAAA)。不難看出，本實施例所利用的CpG ODN的DNA序列僅是簡單地在CpG 0DN1826序列的3’端加上一段不同長度的多聚腺苷酸polyA序列。為了便于后續的表征，該CpG ODN可以首先進行熒光基團FAM在其5’端進行標記，此時對應的 CpG ODN 為 FAM-CpG ODN-po I yA5、FAM-CpG ODN-po IyA 10, FAM-CpG 0DN_polyA15。(3)緩慢加入IM磷酸鹽緩沖液PBS(1M NaCl/0.1M PB,pH7. 4)使其終濃度為0. 1M，PBS (分5 6次加入，大于30min/次間隔)，25°C 400rpm震蕩24h。(4) 13000rpm，4°C，20min 離心，棄上清，加入 500 U I 的 0.1M PBS，如此反復洗 3次，加入適量0.1M PBS重懸，4°C保存待用。通過透射電子顯微鏡TEM表征所獲得的納米金復合物可知，上述方法成功地將CpG ODN偶聯到納米金粒子表面從而形成納米金復合物，該納米金復合物又被稱為polyA tailed CpG ODN-納米金復合物 。具體的表征步驟包括將納米金和所形成的納米金復合物用1%磷鎢酸水溶液(PH7.0)染色，滴于銅網上烘干，然后利用TEM觀察(Jeol, JEM2010, 200KV)。結果如圖1所示，由于納米金本身是不會被染色的，裸露的納米金呈現出圖1A所示的視野；相反，由于納米金復合物表面包裹有DNA (CpG 0DN)，即CpG ODN偶聯到納米金粒子表面，則納米金復合物呈現出圖1B所示的染色后的界面。通過突光分光光度計可以對上述獲得的polyA tailed CpG ODN-納米金復合物進行進ー步表征。具體表征步驟包括將巰基こ醇加入FAM熒光標記的CpG-納米金溶液中至終濃度20mM，震蕩孵育過夜，離心取上清后，用熒光分光光度計測定熒光強度，換算得到DNA的摩爾濃度。結果如圖2所示,不同polyA長度的CpG序列(FAM-CpG ODN-po I yA5>FAM-CpG ODN-poIyAlO、FAM-CpG ODN-poIyAl5)及巰基修飾的 CpG 序列(CpG ODN-SH)組裝到納米金的數量，隨著polyA長度的增加,姆個納米金粒子上組裝的CpG序列條數減少。另外，通過動態光散射粒子分析儀(BECKMAN COULTER, America)可以測定上述獲得的polyA tailed CpG ODN-納米金復合物的水合半徑及分散度，結果如圖3A-圖3D所示，其中，圖3A表示的是CpG ODN-SH與納米金組裝形成的復合物對應的譜圖；圖3B表示的是CpG 0DN-polyA5與納米金組裝形成的復合物對應的譜圖；圖3(表示的是CpG ODN-poIyA 10與納米金組裝形成的復合物對應的譜圖；圖3D表示的是CpG 0DN-polyA15與納米金組裝形成的復合物對應的譜圖；相關的數據歸納為下表1:表I
I平均粒徑大小(ran) I分散系數^
CpG ODN-SH-納米金復合物30. 00. 175
polyA5tailed CpG ODN- 納米金復合物35. 30. 304
polyAlOtailed CpG 0DN-納米金復合物35.90.292
polyA15tailed CpG 0DN-納米金復合物37.60.282由此可知，隨著polyA長度增加，CpG ODN-納米金復合物的粒徑逐漸増大。而且，所形成的各組復合物的分散良好，呈單一分布峰。實施例3細胞活力及攝取率檢測
試劑包括Raw264. 7細胞購自中科院上海細胞庫，噻唑藍(MTT)，十二烷基磺酸鈉(SDS)，Hoechst33258 購自 Sigma-Aldrich 公司，Cy5 標記的熒光修飾 CpGODN 購自invitrogen 公 ロJMTT細胞活力檢測方法(I)前一日鋪板，24孔板每孔鋪2X105個細胞，37°C 5%C02培養過夜。(2) 500 ill PBS洗一次，將新鮮的含有5_25nM的CpG ODN-polyA-納米金的培養基加入各孔，繼續培養24小時(3)每孔加入50iil5mg/ml的MTT，37度孵育4小時后，會有藍紫色不溶甲瓚生成，此時每孔加入10%SDS (pH2-3) Iml溶解甲瓚，37度孵育過夜(4) 12000rpm，20min離心，取200iU上清至96孔板中，0D570nm處測吸光值(參考波長633nm)(5)細胞存活率計算公式生存率=(實驗組OD值/對照組OD值)X 100%細胞攝取率檢測(I) Cy5熒光標記的CpG ODN-po I yA5, CpG ODN-po IyA 15與納米金組裝，組裝方法與實施例2相同，形成polyA5tailed CpG 0DN-納米金復合物、polyA15tailed CpG 0DN-納米金復合物。(2)不同濃度polyA5tailed CpG 0DN-納米金復合物、polyA15tailed CpG 0DN-納米金復合物(5nM、10nM、25nM)分別加入預先鋪好的細胞中，37°C孵育4小時，分別進行流式細胞儀及激光共聚焦顯微鏡檢測。結果如圖4所示,縱坐標表示MTT檢測polyA tailed CpG ODN-納米金復合物細胞活力，由此可以看出所測濃度(5-25nM)范圍內，納米金復合物對細胞活力沒有影響，表現出良好的生物相容性。通過流式細胞儀檢測可以得到納米金復合物的細胞攝取圖，結果如圖5所示，由于單鏈CpG序列(CpG1826，其序列為SEQ ID NO. 4:TCCATGACGITCCTGACGIT)很難進入細胞，所以幾乎沒有檢測到熒光；而polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物可以進入細胞，且檢測到的熒光呈現濃度依賴性變化，即隨著納米金復合物濃度的増大，熒光強度逐漸增加。另外,通過激光共聚焦顯微鏡可以檢測細胞對polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物的攝取，結果如圖6A-圖6D所示，可以直觀從其看到細胞對polyA5tailed CpG ODN-納米金復合物的攝??；相對應的，單鏈Cy5-CpG DNA很難進入細胞，細胞內沒有熒光。實施例4細胞水平免疫刺激檢測
試劑包括Raw264. 7細胞購自中科院上海細胞庫，ELISA抗體及標準品購自eBioscience公司。實驗方法如下(I)鋪24孔板，每孔2X105個Raw264. 7細胞，37°C過夜(2)新鮮培養基含有不同濃度的polyA-tailed CpG-納米金復合物加入各孔,37度孵育 8h (TNF-a ) 0r24h (IL-6, IL-12)(3) 8h、24h取細胞培養上清，進行ELISA檢測。
結果如7A-圖7D所示，圖7A為polyA15tailed CpG ODN-納米金復合物與硫代CpG在不同溶度下的TNF-a分泌水平比較,可以看出，在5nM_25nM范圍內，polyA15tailedCpG ODN-納米金復合物分泌TNF-a多于硫代CpG，且濃度越低，差異越明顯，說明CpGODN-polyA-納米金具有低劑量高免疫刺激活性的特點。圖7B-圖7D分別檢測了不同polyA長度的納米金復合物的TNF-a、IL-6、IL-12細胞因子的分泌，說明polyA tailed CpGODN-納米金復合物具有明顯的免疫刺激活性，并且在CpG濃度相同的情況下，細胞因子的分泌量polyA15tailed CpG ODN-納米金復合物〉polyAlOtailed CpG 0DN-納米金復合物>polyA5tailed CpG 0DN-納米金復合物。實施例5動物體內免疫刺激測試試劑包括 ICR小鼠購自上海斯萊克實驗動物公司；IL_12細胞因子由上海森雄生物科技實業有限公司提供檢測；CBA試劑盒購自BD公司實驗方法如下(1)4-6周大的ICR小鼠飼養在無菌、恒溫的動物房內，稱取體重大約20-25g時用
于實驗。(2)將小鼠隨機分為7組，每組7只。(2)單鏈CpG DNA或不同修飾/組裝的CpG DNA均溶于PBS中，以PBS作為對照，通過尾靜脈注射注入小鼠體內，注射劑量為60ii g/kg(0. lml/10g體重).(3)注射3小時后，將小鼠通過摘眼球放血的方法，取小鼠全血37°C靜置半小吋，3000rpm離心15分鐘后取血清_80度待測(4)血清IL-12及MCP-1含量通過ELISA/CBA試劑盒按照說明書進行檢測。結果如圖8A和圖8B所示，通過實驗動物體內實驗，取血清測得IL-12、MCP_1細胞因子的含量，說明polyA tailed CpG ODN-納米金復合物在體內也具有一定的免疫刺激活性。以上所述的，僅為本發明的較佳實施例，并非用以限定本發明的范圍。凡是依據本發明申請的權利要求書及說明書內容所作的簡單、等效變化與修飾，皆落入本發明專利的權利要求保護范圍。本發明未詳盡描述的均為常規技術內容。
權利要求
1.一種多價免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，包括 (1)提供納米金水溶液； (2)利用多聚腺苷酸修飾CpGODN的3’端得到CpG ODN-polyA ;以及(3)將所述CpGODN-polyA組裝到所述納米金上形成所述多價免疫刺激納米制劑。
2.如權利要求1所述的多價免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，在所述步驟(I)中，通過檸檬酸三鈉水溶液還原氯金酸得到所述納米金水溶液。
3.如權利要求1所述的多價免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)進一步包括 (3.1)將所述納米金水溶液和所述CpG ODN-polyA混合均勻并震蕩反應； (3. 2)分批加入磷酸鹽緩沖液，分離得到所述多價免疫刺激納米制劑。
4.如權利要求3所述的多價免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3.1)之前，步驟(3)進一步包括濃縮所述納米金水溶液。
5.如權利要求3所述的多價免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3. 2)中，所述分離操作包括利用磷酸鹽緩沖液進行洗滌和重懸。
6.如權利要求1所述的多價免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，所述CpGODN-polyA 的序列選自 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO. 2 或 SEQ IDN0. 3。
7.如權利要求1所述的多價免疫刺激納米制劑的制備方法，其特征在于，所述CpGODN-polyA在其5’端進行FAM標記或Cy5標記。
8.—種如權利要求1-7中任一項所述的制備方法所獲得的多價免疫刺激納米制劑，其特征在于，所述多價免疫刺激納米制劑為polyA tailed CpG ODN-納米金復合物。
9.一種如權利要求8所述的多價免疫刺激納米制劑在免疫刺激上的應用。
10.如權利要求9所述的多價免疫刺激納米制劑在免疫刺激上的應用，其特征在于，所述polyA tailed CpG ODN-納米金復合物的濃度為5_25nM。
全文摘要
本發明提供一種多價免疫刺激納米制劑的制備方法，包括(1)提供納米金水溶液；(2)利用多聚腺苷酸修飾CpG ODN的3’端得到CpGODN-polyA；以及(3)將所述CpG ODN-polyA組裝到所述納米金上形成所述多價免疫刺激納米制劑。本發明還提供一種通過該制備方法得到的多價免疫刺激納米制劑及其用途。該多價免疫刺激納米制劑與傳統的CpG ODN相比，具有很高的穩定性，對細胞活力沒有影響，細胞攝取率高，給藥劑量低，免疫刺激活性好，在低劑量時效果尤為突出。
文檔編號A61P37/04GK103007294SQ201210586959
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者黃慶, 陳楠, 魏敏, 裴潔, 李凡, 孫艷紅, 李曉明, 樊春海 申請人:中國科學院上海應用物理研究所