專利名稱：紅景天多糖注射制劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于中藥制藥技術領域，具體涉及紅景天多糖注射制劑及其制備方法。
背景技術：
紅景天為景天科紅景天屬植物，在我國分布廣泛，其中含有高山紅景天、狹葉紅景天、大花紅景天、大株紅景天等藥用品種。紅景天中含有紅景天苷、酪醇、黃酮、多糖等多種有效成分。文獻報道，紅景天中含有的大量紅景天多糖，具有提高免疫、抗病毒、降血糖、抗腫瘤等生物活性。在現有的紅景天為原料的藥物制劑中，主要是以紅景天中除多糖以外的活性成分為有效成分，而大都沒有考慮其中所含的多糖的藥理作用。申請號為CN00115423.0的專利文獻，公開了從大花紅景天中提取的含多糖的大分子提取物制備成片劑、膠囊、顆粒劑等口服劑型用于抗疲勞和抗輻射作用，由于多糖類成分口服生物利用度很低，因此口服給藥效果不理想。
在資料檢索中，未發現有以紅景天多糖為活性成分的注射制劑的任何報道。

發明內容
針對目前國內紅景天多糖利用現狀，我們開發了紅景天多糖注射制劑。
本發明的一個目的是公開紅景天多糖注射制劑。
本發明的另一個目的是公開上述紅景天多糖注射制劑的制備方法。
本發明通過以下方案實現。
一、制備方法(1)取紅景天藥材，粉碎，過40目篩，加8-14倍量水，浸泡半小時，放入超聲提取罐中，進行超聲振蕩提取，時間為30-60分鐘，振蕩頻率為20-80kHz，提取3-4次，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏；(2)將上述浸膏加入30-40倍量60℃-80℃的水，攪拌，靜置片刻，傾出上清液，減壓濃縮至溶液∶藥材為1∶1，加入95％乙醇使得含醇量達70％-90％，靜置24小時，過濾，沉淀備用；(3)將上述沉淀用20-30倍量水溶解，在攪拌下滴加1％鞣酸的同時加溫，煮沸后離心除去沉淀物，繼續加鞣酸至溶液不產生混濁，過已處理好的聚酰胺柱，用4-8倍的水洗脫，收集水洗液，用截留分子量為70000-80000的超濾膜超濾，濾液再用截留分子量為20000-30000的超濾膜超濾，收集未通過液，減壓濃縮，干燥，即得紅景天多糖；(4)制劑的制備水針制劑的制備稱取上述紅景天多糖用注射用水溶解，用葡甲胺調pH值為7.5-8.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成水針制劑。
粉針制劑的制備稱取上述紅景天多糖用注射用水溶解，加入水溶性凍干賦形劑，用葡甲胺調pH值為7.5-8.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，干燥，制備成粉針制劑。
上述紅景天藥材包括高山紅景天、狹葉紅景天、大花紅景天、大株紅景天、西藏紅景天、云南紅景天等。
超聲提取技術是利用超聲波產生強烈振動，高速度，強烈的空化效應，攪拌作用，能破壞藥材的細胞，使溶劑能滲透到藥材細胞中，從而加速藥材中的有效成分溶解于溶劑中。超聲技術提出率高、提取時間短、提取溫度低，在本發明的制備方法中對紅景天藥材的提取，可以使得紅景天多糖有效成分提取率高；溫度低，對于雜質的提取量比起水煎少了很多，對于后續的除雜過程來了方法。
鞣酸除蛋白是經典的方法，但是鞣酸的量不易控制。鞣酸加入過少，對蛋白的沉淀不完全，會使得藥物的安全性下降；加入過多，若不除去，會增加注射時患者的疼痛感。聚酰胺對于鞣酸有很好的吸附作用，對紅景天多糖則沒有吸附作用。利用這一點，可以除去沉淀蛋白所加入的過量的鞣酸和一些能被聚酰胺吸附的雜質，對紅景天多糖進一步純化。
超濾技術是指常溫下以一定壓力和流量，利用不對稱微孔結構和半透膜分離介質、以錯流方式進行過濾，使溶劑及小分子物質通過，高分子物質被濾膜阻留，從而達到分離、純化、濃縮的發展最快的新型膜分離技術。與傳統分離方法相比，具有分離過程無相變、分離效率高、無需添加化學試劑無污染、無需加熱、能耗低、條件溫和不破壞成分、操作方便、流程短的特點。本發明利用超濾技術，選擇合適的超濾膜，去除了無活性的大分子和小分子物質，對具有活性的紅景天多糖進一步純化。
根據我們的研究發現，紅景天多糖隨分子量增大，藥理作用更好，但分子量大于100000，則聯接有多種基團，容易產生嚴重的不良反應，臨床上表現出藥物毒副反應發生。因此我們在制備過程中，截留了分子量20000-80000部分。
二、不同分子量紅景天多糖的安全性評價將紅景天多糖總提物用超濾膜超濾，分為分子量小于20000(小分子組)、20000-80000(中分子組)、大于80000(大分子組)三個范圍的多糖成分。
過敏反應又稱變態反應，是機體受某些抗原物質刺激所產生的特異反應，一般認為能誘發過敏反應的抗原物質主要是蛋白質、多肽、多糖等大分子物質(具有完全抗原性、為全抗原)。本發明利用過敏反應來進一步觀察本發明制劑的安全性。
取健康無傷豚鼠30只，體重250-300g，隨機分為三組，每組10只，分別為紅景天多糖小分子注射液組、紅景天多糖中分子注射液組、紅景天多糖大分子注射液組。分別按無菌操作，每天每只肌肉注射供試品4.0ml，共5次。觀察注射后動物的過敏反應癥狀。
結果紅景天多糖大分子注射液組中有4只豚鼠出現了過敏反應，而紅景天多糖小分子注射液組、紅景天多糖中分子注射液組中豚鼠的過敏反應發生率為零。說明紅景天分子量大于80000的多糖注射給藥很容易出現不良反應，安全性不好。
三、不同分子量紅景天多糖的藥效學實驗本實驗所用紅景天多糖樣品同上，由廣東天之驕藥物開發有限公司實驗室提供，實驗時用生理鹽水配成所需濃度。
選用昆明種雄性小鼠30只，18-22g。將接種后7天的H22瘤株荷瘤小鼠頸椎脫臼處死，在無菌條件下取出腹水，用生理鹽水1∶3稀釋，于腋窩皮下接種瘤液0.2ml。接種后24小時，將動物隨機分為3組，每組10只。設空白對照組，紅景天多糖小分子注射液組、紅景天多糖中分子注射液組。各組給藥劑量為50mg/kg，空白對照組給予等體積的生理鹽水。每日1次，連續給藥10天。末次給藥后，頸椎脫臼處死動物，分別稱體重、瘤重，計算腫瘤抑制率，進行療效評價。
腫瘤生長抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％實驗結果見表1。
表1 對小鼠肝癌H22生長的抑制作用(X±S)組別 鼠只(只) 瘤重(g)抑制率(％)空白對照組10 2.34±0.74-紅景天多糖小分子組10 2.22±0.685.1紅景天多糖中分子組10 1.12±0.5052.1**注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；
由表1實驗結果可以看出紅景天多糖中分子注射制劑能顯著抑制小鼠肝癌H22生長的作用，與對照組比較有顯著性的差異(P＜0.01)。而紅景天多糖小分子注射制劑與對照組比較對小鼠肝癌H22生長無抑制作用(P＞0.05)。
四、藥理實施例本實驗所用的紅景天多糖均為分子量為20000-80000的多糖，由廣東天之驕藥物開發有限公司實驗室提供。
1、在體內對小鼠脾細胞增殖的影響將30只BALB/C小鼠隨機分成3組，每組10只。用藥組腹腔注射紅景天多糖(75mg/kg)，對照組注射生理鹽水，連續注射10天。取脾制成2.5×106個細胞/ml懸液，于96孔平底細胞培養板每孔中加入上述細胞懸液200μl和20μl不同濃度的紅景天多糖以及伴刀豆球蛋白(2.5mg/L)或細菌脂多糖(5mg/L)或RP MI1640液，孵育72h，收獲前6h每孔加入1.85×104Bq3H-TdR，將細胞收集于49型濾紙上，測定每分種閃爍數(cpm)。方差齊性檢驗單因素方差分析t檢驗、相關系數、假設檢驗。統計分析采用STATA軟件。
結果紅景天多糖對脾細胞的直接活化作用在RP MI1640孔中，紅景天多糖對脾細胞增殖有明顯促進作用，表明單獨應用紅景天多糖具有絲裂原樣活性。
在伴刀豆球蛋白或細菌脂多糖刺激下紅景天多糖對脾細胞具有增殖作用。紅景天多糖雖能促進靜止狀態的脾細胞活化，但遠低于伴刀豆球蛋白或細菌脂多糖誘導淋巴細胞轉化率。紅景天多糖與伴刀豆球蛋白或細菌脂多糖合用，可顯著增強脾細胞增殖作用。紅景天多糖和伴刀豆球蛋白(或細菌脂多糖)復合效應與紅景天多糖、伴刀豆球蛋白(或細菌脂多糖)單獨效應之和的比值大于1，說明紅景天多糖在體外可促進脾細胞對伴刀豆球蛋白和細菌脂多糖刺激的增殖作用。
2、紅景天多糖的降血糖、降血脂作用動物昆明種小白鼠，體重20.0±2.0g，雌雄兼用。
藥品四氧嘧啶為Sigma公司的產品。鹽酸腎上腺素由北京市永康藥業有限公司生產。
方法血糖含量測定用鄰苯胺法，肝糖原含量測定用碘試劑法，血總脂含量測定用香草醛微量法。實驗數據均經t檢驗處理，結果以X±SD表示。
結果2.1紅景天多糖一次給藥對小鼠血糖、肝糖原和血總脂含量的影響結果表明紅景天多糖在所用劑量下對正常小白鼠血糖、肝糖原和血總脂均有明顯降低作用，與對照組比較差異顯著(P＜0.01)。
2.2紅景天多糖多次給藥對小鼠血糖、肝糖原和血總脂含量的影響結果表明小鼠多次注射紅景天多糖后，同樣引起血糖、肝糖原和血總脂含量降低。
2.3紅景天多糖對腎上腺素所致高血糖小鼠血糖的影響小鼠60只，隨機分為4組，正常組與模型組ip生理鹽水10ml/kg，其余兩組分別ip紅景天多糖50，100mg/kg，每日1次，連續7日。待末次給藥后20min，除正常對照組外，其余各組小鼠ip腎上腺素(Adrenaline，Adr)100μg/kg，于注射后15min，取血和肝，分別測血糖、肝糖原和血總脂。
結果表明紅景天多糖可降低Adr引起的高血糖，增強Adr降解肝糖原作用。
2.4紅景天多糖對葡萄糖所致高血糖小鼠血糖的影響小鼠90只，隨機分為3組，第一、二組ip生理鹽水10ml/kg，第三組ip紅景天多糖100mg/kg，每日1次，連續7日，末次給藥后，第二、三組小鼠ip葡萄糖2g/kg，第一組ip等體積生理鹽水。分別于注射后2、30、60、120、240min取血和肝，測血糖、肝糖原和血總脂。
結果表明連續ip紅景天多糖對葡萄糖引起的高血糖和肝糖原水平的增高均有明顯的抑制作用，并能降低血總脂含量。
2.5紅景天多糖對四氧嘧啶所致小鼠高血糖的影響小鼠60只，其中10只為對照組，其余50只分別ip四氧嘧啶80mg/kg，于中毒后第四日測血糖一次，將血糖在6.80-10.20mmol/L的小鼠45只，隨機分為3組。于中毒后第4日，正常對照組和中毒對照組每日ip生理鹽水10ml/kg，其余兩組每日分別ip紅景天多糖100，200mg/kg于中毒后第8日ip紅景天多糖半小時后取血和肝，分別測血糖、肝糖原和血總脂。
結果表明連續ip紅景天多糖可明顯降低四氧嘧啶引起高血糖，其降糖作用強度隨劑量增加而加強，同時也有降低肝糖原和血總脂作用。
總結實驗結果表明，一次或多次ip紅景天多糖對正常小鼠血糖和各種實驗性高血糖均有降低作用，說明紅景天多糖具有明顯的降糖作用，其作用強度隨劑量增加而加強。紅景天多糖可降低葡萄糖引起的肝糖原增加和加強腎上腺素和四氧嘧啶對肝糖原的分解。同時紅景天多糖對血總脂也有降低作用。
三、制備實施例實施例1(1)取高山紅景天藥材，粉碎，過40目篩，加14倍量水，浸泡半小時，放入超聲提取罐中，進行超聲振蕩提取，時間為60分鐘，振蕩頻率為20kHz，提取4次，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏；(2)將上述浸膏加入40倍量80℃的水，攪拌，靜置片刻，傾出上清液，減壓濃縮至溶液∶藥材為1∶1，加入95％乙醇使得含醇量為90％，靜置24小時，過濾，沉淀備用；(3)將上述沉淀用30倍量水溶解，在攪拌下滴加1％鞣酸的同時加溫，煮沸后離心除去沉淀物，繼續加鞣酸至溶液不產生混濁，過已處理好的聚酰胺柱，用4倍的水洗脫，收集水洗液，用截留分子量為70000的超濾膜超濾，濾液再用截留分子量為20000的超濾膜超濾，收集未通過液，減壓濃縮，干燥，即得紅景天多糖；(4)稱取上述紅景天多糖20g，用注射用水溶解，用葡甲胺調節pH值為7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成水針制劑1000支。
實施例2(1)取狹葉紅景天藥材，粉碎，過40目篩，加8倍量水，浸泡半小時，放入超聲提取罐中，進行超聲振蕩提取，時間為30分鐘，振蕩頻率為80kHz，提取3次，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏；(2)將上述浸膏加入30倍量60℃的水，攪拌，靜置片刻，傾出上清液，減壓濃縮至溶液∶藥材為1∶1，加入95％乙醇使得含醇量為70％，靜置24小時，過濾，沉淀備用；(3)將上述沉淀用20倍量水溶解，在攪拌下滴加1％鞣酸的同時加溫，煮沸后離心除去沉淀物，繼續加鞣酸至溶液不產生混濁，過已處理好的聚酰胺柱，用8倍的水洗脫，收集水洗液，用截留分子量為80000的超濾膜超濾，濾液再用截留分子量為30000的超濾膜超濾，收集未通過液，減壓濃縮，干燥，即得紅景天多糖；(4)稱取上述紅景天多糖20g，用注射用水溶解，加入聚乙烯吡咯烷酮，用葡甲胺調節pH值為8.5，用0.22μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥，制備成凍干粉針制劑1000支。
實施例3(1)取大花紅景天藥材，粉碎，過40目篩，加10倍量水，浸泡半小時，放入超聲提取罐中，進行超聲振蕩提取，時間為50分鐘，振蕩頻率為60kHz，提取3次，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏；
(2)將上述浸膏加入35倍量70℃的水，攪拌，靜置片刻，傾出上清液，減壓濃縮至溶液∶藥材為1∶1，加入95％乙醇使得含醇量為80％，靜置24小時，過濾，沉淀備用；(3)將上述沉淀用25倍量水溶解，在攪拌下滴加1％鞣酸的同時加溫，煮沸后離心除去沉淀物，繼續加鞣酸至溶液不產生混濁，過已處理好的聚酰胺柱，用6倍的水洗脫，收集水洗液，用截留分子量為75000的超濾膜超濾，濾液再用截留分子量為25000的超濾膜超濾，收集未通過液，減壓濃縮，干燥，即得紅景天多糖；(4)稱取上述紅景天多糖20g，用注射用水溶解，用葡甲胺調節pH值為7.5，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成水針制劑1000支。
實施例4(1)取大株紅景天藥材，粉碎，過40目篩，加12倍量水，浸泡半小時，放入超聲提取罐中，進行超聲振蕩提取，時間為45分鐘，振蕩頻率為40kHz，提取4次，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏；(2)將上述浸膏加入37倍量75℃的水，攪拌，靜置片刻，傾出上清液，減壓濃縮至溶液∶藥材為1∶1，加入95％乙醇使得含醇量為85％，靜置24小時，過濾，沉淀備用；(3)將上述沉淀用22倍量水溶解，在攪拌下滴加1％鞣酸的同時加溫，煮沸后離心除去沉淀物，繼續加鞣酸至溶液不產生混濁，過已處理好的聚酰胺柱，用5倍的水洗脫，收集水洗液，用截留分子量為78000的超濾膜超濾，濾液再用截留分子量為23000的超濾膜超濾，收集未通過液，減壓濃縮，干燥，即得紅景天多糖；(4)稱取上述紅景天多糖20g，用注射用水溶解，加入果糖，用葡甲胺調節pH值為8.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥，制備成凍干粉針制劑1000支。
實施例5
(1)取云南紅景天藥材，粉碎，過40目篩，加11倍量水，浸泡半小時，放入超聲提取罐中，進行超聲振蕩提取，時間為35分鐘，振蕩頻率為30kHz，提取3次，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏；(2)將上述浸膏加入33倍量65℃的水，攪拌，靜置片刻，傾出上清液，減壓濃縮至溶液∶藥材為1∶1，加入95％乙醇使得含醇量為75％，靜置24小時，過濾，沉淀備用；(3)將上述沉淀用28倍量水溶解，在攪拌下滴加1％鞣酸的同時加溫，煮沸后離心除去沉淀物，繼續加鞣酸至溶液不產生混濁，過已處理好的聚酰胺柱，用7倍的水洗脫，收集水洗液，用截留分子量為73000的超濾膜超濾，濾液再用截留分子量為26000的超濾膜超濾，收集未通過液，減壓濃縮，干燥，即得紅景天多糖；(4)稱取上述紅景天多糖20g，用注射用水溶解，用葡甲胺調節pH值為7.3，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成水針制劑1000支。
實施例6(1)取西藏紅景天藥材，粉碎，過40目篩，加9倍量水，浸泡半小時，放入超聲提取罐中，進行超聲振蕩提取，時間為40分鐘，振蕩頻率為50kHz，提取4次，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏；(2)將上述浸膏加入35倍量70℃的水，攪拌，靜置片刻，傾出上清液，減壓濃縮至溶液∶藥材為1∶1，加入95％乙醇使得含醇量為82％，靜置24小時，過濾，沉淀備用；(3)將上述沉淀用25倍量水溶解，在攪拌下滴加1％鞣酸的同時加溫，煮沸后離心除去沉淀物，繼續加鞣酸至溶液不產生混濁，過已處理好的聚酰胺柱，用6倍的水洗脫，收集水洗液，用截留分子量為75000的超濾膜超濾，濾液再用截留分子量為28000的超濾膜超濾，收集未通過液，減壓濃縮，干燥，即得紅景天多糖；
(4)稱取上述紅景天多糖20g，用注射用水溶解，加入葡萄糖，用葡甲胺調節pH值為8.2，用0.22μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥，制備成凍干粉針制劑1000支。
權利要求
1.紅景天多糖注射制劑，其特征在于，它是由分子量20000-80000的多糖和水溶性注射用藥用輔料制備而成的。
2.紅景天多糖注射制劑的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟(1)取紅景天藥材，粉碎，過40目篩，加8-14倍量水，浸泡半小時，放入超聲提取罐中，進行超聲振蕩提取，時間為30-60分鐘，振蕩頻率為20-80kHz，提取3-4次，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏；(2)將上述浸膏加入30-40倍量60℃-80℃的水，攪拌，靜置片刻，傾出上清液，減壓濃縮至溶液∶藥材為1∶1，加入95％乙醇使得含醇量達70％-90％，靜置24小時，過濾，沉淀備用；(3)將上述沉淀用20-30倍量水溶解，在攪拌下滴加1％鞣酸的同時加溫，煮沸后離心除去沉淀物，繼續加鞣酸至溶液不產生混濁，過已處理好的聚酰胺柱，用4-8倍的水洗脫，收集水洗液，用截留分子量為70000-80000的超濾膜超濾，濾液再用截留分子量為20000-30000的超濾膜超濾，收集未通過液，減壓濃縮，干燥，即得紅景天多糖；(4)制劑的制備水針制劑的制備稱取上述紅景天多糖用注射用水溶解，用葡甲胺調pH值為7.5-8.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成水針制劑。粉針制劑的制備稱取上述紅景天多糖用注射用水溶解，加入水溶性凍干賦形劑，用葡甲胺調pH值為7.5-8.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，干燥，制備成粉針制劑。
3.根據權利要求1所述的紅景天多糖注射制劑，具有提高免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤作用。
全文摘要
本發明屬于中藥制藥技術領域，具體涉及紅景天多糖注射制劑，它是由分子量20000－80000的紅景天多糖和水溶性注射用藥用輔料制備而成的。本發明還涉及上述粉針劑的制備方法。實驗結果證明，本發明制備方法得到的紅景天多糖具有提高免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤作用。
文檔編號A61K31/715GK1686157SQ20051005677
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月25日 優先權日2005年3月25日
發明者張海峰 申請人:張海峰