專利名稱：殼聚糖-5’ppp-NS1shRNA納米復(fù)合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米分子的合成及基因工程技術(shù)，具體涉及到殼聚糖-5’ PPP-NSlshRNA納米復(fù)合物的制備方法。
背景技術(shù)：
維甲酸誘導(dǎo)基因I (retinoic acid inducible gene I，RIG-I)為我國(guó)學(xué)者于 1997年從人急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)NB4細(xì)胞株中首次克隆。RIG-I作為胞質(zhì)shRNA受體，通過(guò)其helicase結(jié)合shRNA和ATP，ATP水解致RIG_I_shRNA 構(gòu)象改變，暴露其CARD，與下游接頭蛋白質(zhì)干擾素啟動(dòng)子刺激因子-I (IPS-I)的CARD相互作用，下傳信號(hào)，激活NF-KB和IRF等轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)和分泌，引發(fā)抗病毒天然免疫應(yīng)答。但裸露的shRNA進(jìn)人組織后迅速被組織內(nèi)的RNase水解，因此需要構(gòu)建一個(gè)能有效保護(hù)RNA并能被組織更好吸收的RNA運(yùn)載體系。本專利采用分步法制備的RNA殼聚糖納米粒，制備方法簡(jiǎn)單、可行，制劑穩(wěn)定性，對(duì)包裹的RNA具有較好的保護(hù)作用。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示殼聚糖與RNA形成表面帶正電荷的納米顆粒，使RNA被保護(hù)不受RNase的降解；殼聚糖_5’ppp-NS I shRNA納米復(fù)合物能激活RIG-I，誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)和分泌。5’ppp-NSlshRNA是流感病毒的RNA，殼聚糖-5’ ppp -NSlshRNA納米復(fù)合物的研制為進(jìn)一步研究通用流感病毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種殼聚糖_5’ ppp -NSlshRNA納米復(fù)合物的制備方法。并公開(kāi)殼聚糖-5’ppp -NSshRNA納米復(fù)合物作為制備基因藥物載體方面的應(yīng)用。本發(fā)明使用殼聚糖作為基因藥物載體生物體內(nèi)給藥系統(tǒng)，取得了很好的效果。殼聚糖及其衍生物具有良好結(jié)黏附性，廣泛用于祀向給藥。殼聚糖及其衍生物和病毒外膜蛋白NSl shRNA通過(guò)靜電作用形成復(fù)合物，保護(hù)shRNA免于核酶降解、提高細(xì)胞攝取及胞內(nèi)shRNA釋放，已成功應(yīng)用于shRNA的體內(nèi)轉(zhuǎn)染。本發(fā)明利用殼聚糖作為載體，把流感病毒的NSlshRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，進(jìn)入細(xì)胞中的NSlshRNA被RIG-I所識(shí)別后，誘導(dǎo)RIG-I發(fā)生構(gòu)象改變，暴露出原來(lái)隱蔽在蛋白質(zhì)內(nèi)部的CARD,以便與下游信號(hào)銜接蛋白VISA(又稱為IPS1、MAVS或Cardif)的CARD結(jié)構(gòu)域相互作用。VISA位于線粒體外膜，可通過(guò)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的TRAF3將RIG-I的激活信號(hào)傳遞給下游的TBKl和IKK蛋白激酶，導(dǎo)致IRF3/7和NF_kB的激活和干擾素基因的表達(dá)，引發(fā)抗病毒天然免疫應(yīng)答。殼聚糖-NSlshRNA納米復(fù)合物的制備方法包括以下步驟
第一步殼聚糖納米顆粒的制備方法
殼聚糖，脫乙酰度>85%，粘度< 100。本發(fā)明使用的藥品全部是分析級(jí)試劑，所制備的納米顆粒形態(tài)大多成球形，平均粒徑約為480nm，多分散度〈O. 25，zeta電位約為25 mV。第二步病毒外膜蛋白NSl基因的獲得和5’ ppp- shRNA的合成病毒的NS基因(890 bp)編碼非結(jié)蛋白NS1、NS2。每個(gè)節(jié)段的兩端具有末端重復(fù)序列，所有節(jié)段的3端核苷酸序列相同。5端有與3端核苷酸序列互補(bǔ)的保守區(qū)段和重復(fù)序列。根據(jù)NCBI登錄的流感病毒A/PR/8/1934 (HlNl)株的NSl基因，我們進(jìn)行了設(shè)計(jì)，選取了其中21個(gè)堿基序列用于本實(shí)驗(yàn)的研究，堿基序列為T(mén)GAGGATGTCAAAAATGCAGT。委托鼎國(guó)生物公司合成了 21個(gè)核苷酸的NSlshRNAj^WT 5’ ppp的帽狀結(jié)構(gòu)。第三步殼聚糖_5’ ppp-NSlshRNA納米復(fù)合物的合成
把殼聚糖納米顆粒、5’ ppp-NS I shRNA按質(zhì)量比為1:5的比例混合,殼聚糖納米顆粒帶有正電荷，5’ppp-NSl shRNA帶有負(fù)電荷，通過(guò)靜電的作用形成殼聚糖-5’ppp-NSlshRNA納米復(fù)合物；用5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)殼聚糖與5’ ppp- NSlshRNA的結(jié)合情況。本發(fā)明使用的天然陽(yáng)離子聚合物殼聚糖，具有生物可降解、無(wú)免疫原性及低毒等特性，其分子結(jié)構(gòu)中具有活潑氨基，可連接不同功能基團(tuán)，如質(zhì)子化基團(tuán)(季銨基團(tuán))、PH敏感基團(tuán)、巰基和各種細(xì)胞表面受體特異性配體等，形成殼聚糖衍生物。殼聚糖及其衍生物具 有良好的黏附性，廣泛用于靶向給藥。殼聚糖及其衍生物和病毒NSlshRNA通過(guò)靜電作用形成復(fù)合物，保護(hù)shRNA免于核酶降解、提高細(xì)胞攝取及胞內(nèi)shRNA釋放，并能成功將shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的shRNA能靶定RIG-I基因，誘導(dǎo)RIG-I發(fā)生構(gòu)象改變，以便與下游信號(hào)銜接蛋白VISA相互作用，導(dǎo)致IRF3/7和NF_kB轉(zhuǎn)錄因子的激活和誘導(dǎo)干擾素基因的表達(dá)，引發(fā)抗病毒天然免疫應(yīng)答。具體實(shí)施方案
本發(fā)明的具體實(shí)施包括以下內(nèi)容
實(shí)施例I:
第一步殼聚糖納米顆粒的制備
I、微乳液A的合成22 mL環(huán)己烷；8 mL己醇；200 μ L殼聚糖；400 μ L殼聚糖-Rh ；2.6 mL Triton XlOO，將上述溶液混合，攪拌30分鐘，直到得到溶液清晰，得到微乳液A。2、微乳液B的合成
在尚心管中放入分子質(zhì)量為150. 09的NHS 100 μ L ;分子質(zhì)量為115. 09的酒石酸200μ L ;分子質(zhì)量為190的EDC 300 μ L，將上述溶液混合，終濃度為O. 2Μ。溶液靜止20分鐘后，把全部溶液放到微乳液A中去，攪拌過(guò)夜(至少16小時(shí))，得到微乳液B。3、在上述微乳液B中溶液中加入I mL的乙醇溶液，8，000 rpm，離心20 min，去上清。添加ImL的乙醇，8000 rpm，再離心10分鐘，再重復(fù)以上步驟兩次。獲得的殼聚糖納米顆粒在I - 2 mL HPLC級(jí)水中再溶解；在去離子水中透析的I-2天(每天換水)。第二步病毒外膜蛋白NSl基因的獲得和5’ ppp- NSlshRNA的合成
病毒的NS基因(890 bp)編碼非結(jié)蛋白NS1、NS2。每個(gè)節(jié)段的兩端具有末端重復(fù)序列，所有節(jié)段的3端核苷酸序列相同。根據(jù)NCBI登錄的流感病毒A/PR/8/1934(HlNl)株的NSl基因，選取其中21個(gè)堿基，委托鼎國(guó)生物公司合成21個(gè)核苷酸的NSlshRNA，加了5’ ppp 的帽狀結(jié)構(gòu)，堿基序列為5’ ppp-TGAGGATGTCAAAAATGCAGT。第三步殼聚糖_5’ ppp - NSlshRNA納米復(fù)合物的合成
把殼聚糖納米顆粒、5’ ppp -NSl shRNA的水溶液按質(zhì)量比的I :5比例混合，形成殼聚糖-5’ppp - NSlshRNA納米復(fù)合物。用5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)殼聚糖與5’ppp - NSlshRNA的結(jié)合情況。實(shí)施例2:
殼聚糖-5’ ppp - NSlshRNA納米復(fù)合物的應(yīng)用
I.細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16-BlueINF_a/i3細(xì)胞，使消化后細(xì)胞的濃度在4. 2X105cell/ml，取180ul/孔細(xì)胞液接種于96孔板培養(yǎng)板上，每孔加20 ul的殼聚糖-5’ppp - NSlshRNA納米復(fù)合物，殼聚糖納米顆粒、5’ppp -NSl shRNA的水溶液按質(zhì)量比的I :5混合，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)，培養(yǎng)24h。2.細(xì)胞培養(yǎng)24h后，每孔取細(xì)胞上清液20 ul添加在新的96孔的酶標(biāo)板里，再取180ul的QUANTI-Blue檢測(cè)溶液放在每個(gè)小孔中，將酶標(biāo)板置于CO2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后。24h后，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上，在655nm上檢測(cè)細(xì)胞中分泌型堿性磷酸酶活性。3.如果殼聚糖納米顆粒把NSl shRNA轉(zhuǎn)染到B16_Blue INF- a / β細(xì)胞中去，NSl·shRNA就會(huì)激活RIG-I基因及其下游基因IRF3/5和ISRE ；IRF3/5基因激活干擾素基因，產(chǎn)生的干擾素和細(xì)胞受體結(jié)合，激活I(lǐng)RF9基因，最后產(chǎn)生ISG54基因。產(chǎn)生的ISRE和ISG54相互作用，細(xì)胞產(chǎn)生分泌型堿性磷酸酶，上清液呈現(xiàn)藍(lán)色，在655nm上就可以檢測(cè)到它的活性，說(shuō)明有干擾素的產(chǎn)生及干擾素量的變化。
權(quán)利要求
1.殼聚糖-5’PPP-NSshRNA納米復(fù)合物的制備方法,其特征是 第一步殼聚糖納米顆粒的制備 1)、微乳液A的合成22mL環(huán)己烷；8 mL己醇；200 μ L殼聚糖；400 yL殼聚糖-Rh;2.6 mL Triton XlOO混合，攪拌，直到得到溶液清晰，得到微乳液A ; 2)、微乳液B的合成 在離心管中放入MW為150. 09的100 μ L NHS O ;MW為115. 09的200 μ L酒石酸；■為190的300 μ L EDC離心使溶液應(yīng)該達(dá)到O. 2Μ，靜止20分鐘，然后把全部溶液放到微乳液A中去，攪拌過(guò)夜，至少16小時(shí)，得到微乳液B ; 3)、在上述微乳液B中溶液中加入ImL的乙醇溶液，8，000 rpm離心，去上清然后添加ImL的乙醇，8000 rpm，再離心，再重復(fù)以上步驟兩次，獲得的殼聚糖納米顆粒在I - 2 mLHPLC級(jí)水中再溶解，在去離子水中透析的I - 2天，每天換水； 第二步病毒外膜蛋白NSl基因的獲得和5’ PPP- NSlshRNA的合成 病毒的NS基因890 bp編碼非結(jié)蛋白NS1、NS2，每個(gè)節(jié)段的兩端具有末端重復(fù)序列，所有節(jié)段的3端核苷酸序列相同，根據(jù)NCBI登錄的流感病毒A/PR/8/1934(HlNl)株的NSl基因，選取其中19個(gè)堿基，委托鼎國(guó)生物公司合成19個(gè)核苷酸的NSlshRNA，加了 5’ppp的帽狀結(jié)構(gòu)，堿基序列為5’ ppp-TGAGGATGTCAAAAATGCA ； 第三步殼聚糖_5’ ppp - NSlshRNA納米復(fù)合物的合成 把殼聚糖納米顆粒、5’ ppp NSl shRNA的水溶液按質(zhì)量比的I :5比例混合，形成殼聚糖-5’ppp - NSlshRNA納米復(fù)合物，用5%凝膠電泳檢測(cè)殼聚糖與5’ppp NSlshRNA的結(jié)合情況。
2.殼聚糖_5’ppp-NSshRNA納米復(fù)合物作為制備基因藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米分子的合成及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到殼聚糖-NS1shRNA納米復(fù)合物的制備方法。把殼聚糖納米顆粒、NS1shRNA按一定的比例混合，通過(guò)靜電的作用形成殼聚糖-NS1shRNA納米復(fù)合物，利用殼聚糖作為載體把病毒的NS1基因、shRNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，和宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體RIG-I樣受體(RIG-I likereceptors,RLRs)結(jié)合，能結(jié)合shRNA并激活下游的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),激活天然免疫系統(tǒng)和乳細(xì)胞內(nèi)抗病毒的干擾素通路，誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生，最終清除感染體內(nèi)的病毒。本發(fā)明使用殼聚糖作為基因藥物的生物體外及生物體內(nèi)給藥系統(tǒng)，取得了很好的效果，能應(yīng)用于shRNA的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染。
文檔編號(hào)A61K39/145GK102895674SQ201210384100
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月12日
發(fā)明者趙麗輝, 趙赫楠, 韓德明, 賈凱莉, 王麗麗 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春理工大學(xué)