專利名稱：子宮內裝置、其生產方法以及將活性因子置于子宮腔內的方法
技術領域：
本發明一般性涉及子宮內裝置(intrauterine device)且特別是出于治療目的將因子(element)置于子宮腔內的方法。子宮腔是一個解剖學位置，不容易直接進入其中，而且至今子宮內裝置僅用于避孕方法領域中。然而，子宮腔借助于合適的子宮內裝置可用于一些其它目的，特別用于直接治療子宮壁(子宮內膜和/或子宮肌膜)病變、暫時性體內胚胎/卵培育及作為合適的施用途徑以到達全身血液系統。本發明提供了這方面的方法。
本發明涉及一種可取式子宮(子宮腔或輸卵管)內裝置，特別用于將配子或胚胎移植入子宮(或輸卵管)，使得可在輔助生殖技術(ART)中進行體內及子宮內(或輸卵管內)受精和/或植入前發育。
本發明還涉及一種相似的子宮內裝置以將通過基因轉染而遺傳學修飾的細胞系植入子宮內，以將分子輸送于子宮內膜附近而無全身作用并允許在ART或自然受精后在胚胎移植之前更特異性改變及預處理子宮內膜，或者相反地作為標準宮內節育器(IUD)以避免任何妊娠(避孕)。
本發明還涉及一種相似的子宮內裝置，使得可以將各種活性因子輸送于子宮腔內。
特別地，所述活性因子可以是配子/胚胎及用于分泌生物活性因子的通過基因轉染而遺傳學修飾的細胞系，后者的目的是為改善體內培育配子/胚胎(胚胎可得自克隆或任何其它技術)的子宮內環境。
本發明可應用于任何哺乳動物物種。
根據第一方面，本發明涉及生殖醫學，特別是在輔助生殖技術中體外受精(IVF)及使用與細胞包囊技術(cell encapsulation technology)相關的子宮內裝置經由子宮輸送藥物。
自1978年開始，IVF已經成為處理大多數不孕癥患者致病原因的優選方法。作為IVF方法的一部分，生殖細胞(卵母細胞和精子)及所得受精的卵母細胞(受精卵，胚胎)根據特異方法使用適于該方法中每個特異步驟的體外培養基處理。
標準體外受精(IVF)包括以下步驟-成熟(卵母細胞募集)為保證一個以上的卵母細胞成熟，將婦女在實際受精之前用激素處理。通常地，將婦女用破壞腦(下丘腦和垂體)與卵巢之間正常激素控制信號的一種因子(GnRH激動劑)處理14-21天。之后根據卵巢應答情況施用10-20天相對大劑量的卵泡刺激素(FSH)。FSH刺激許多卵泡成熟，每個卵泡均含有一個卵母細胞。
當卵母細胞準備排卵時，施用人絨毛膜促性腺激素(hCG)以完成卵母細胞成熟。
-抽吸卵母細胞在體內成熟后，使用超聲導向卵泡穿刺(ultrasound guided follicularpuncture)從婦女卵巢中收集卵母細胞。
-受精及胚胎培養體外受精通過向卵母細胞中加入精子(體外受精IVF)或者通過微注射在每個成熟的卵母細胞中注入一個精子(胞質內精子注射，ICSI)而獲得。受精的卵母細胞在生殖道外的IVF培養基中培養2-5天。
-胚胎移植在體外培養胚胎2-5天后，選擇幾個胚胎并用一個細管將其移植至婦女的子宮內。
體外受精和胚胎培養的最終目標是提供高質量的胚胎，其能持續正常發育并分娩存活。
-針對植入前胚胎發育進行體外培養近20年來盡管用IVF及最近用胞質內精子注射(ICSI)治療患者，但移植的每個胚胎的植入率還較低，平均為大約20％。
世界上大多數IVF中心在第2或第3天進行胚胎移植，即在生理學植入期之前3或2天進行移植。胚胎生理學和新陳代謝領域的新近進展導致新的貫序無血清培養基形成，其設計為模擬胚胎沿著生殖道行進的動態環境(Gardner等，1996)。貫序培養系統(G1.2/G2.2)具有最高比率的胚泡形成，但仍低達50％(Gardner等，1998)。
將胚胎培養至胚泡階段的基本原理是這使得可以進行選擇以移植具有經證實的發育能力的胚胎。另外，將胚泡轉移至子宮內與轉移一個早期分裂的胚胎相比在生理學上更接近體內情況，其正常存在于輸卵管中且沒有從子宮內逐出的危險，因為在胚胎植入之前的時間減少。
最近的論文揭示將受精卵與人子宮內膜上皮(Simon等，1999)和/或基質細胞(Barmat等，1998)在體外共同培養對每個前胚胎的卵裂球數，發育為桑椹胚-卵裂球期的比率，自然培育的比率及胞質片段的百分率，及植入比率具有有益作用，如近來Spandorfer等，2002所述。
在1994年美國和加拿大的輔助生殖技術活動的報道中，配子輸卵管內轉移(GIFT)及合子輸卵管內轉移(ZIFT)與體外受精相比具有較高的臨床妊娠率。最近Levran等在2002年表明合子輸卵管內轉移與在標準IVF之后轉移胚泡相比改良了重復植入失敗的結果。
這些發現提示合子存在于上段生殖道中對得益于子宮液中存在的所有已知和未知的生長因子的胚胎發育及其在植入過程期間侵潤子宮內膜的潛力是重要的。
另外，在牛體內進行的研究近來表明在體內產生的胚胎與具有更多的細胞內通訊手段(Boni等，1999)及特別是成熟的線粒體(Crosier等，2000)的體外產生的胚胎相比很少變化。
所有上述研究證實，盡管已經努力通過模擬子宮液特性而使培養基最佳化，但體外的胚胎植入前發育還遠未達到優化。
本發明提供了ART中的一種新方法，使用細胞包囊技術以特別使IVF程序(或者克隆所有其它哺乳動物物種)中的配子和/或植入前合子/胚胎從在子宮中暫時自然培育受益。
另外，控制子宮內培育的時間可產生更好質量的胚胎發育及因此具有較高的植入率，而且如果胚泡轉移在ART單位中很普遍，則與標準IVF相比具有較低花費的經濟學優勢。
根據第二方面，本發明涉及通過植入可能經過遺傳學修飾的組織、細胞或細胞系而子宮內輸送活性因子，特別是進行細胞治療。
在所有哺乳動物物種中，植入的成功與良好質量的胚胎和接受子宮內膜之間的完美通訊相關。
在輔助生殖技術(ART)領域中，臨床醫生對子宮內膜接受性的復雜情況的控制限于通過施用17β雌二醇和孕酮以模擬生理學的貫序的卵泡和黃體期進行內分泌處理。
在基礎科學文獻中，大多數研究目前集中在使用體外和體內模型如缺乏目的分子的基因敲除小鼠來研究胚胎和子宮內膜之間的圍植入期(periimplantation)的旁分泌學。例如，已經揭示了在整聯蛋白β1缺陷小鼠(Fassler和Meyer，1995)及具有白細胞介素II受體α鏈無效突變的雌性小鼠(Robb等，1998)中，胚胎不能植入。
然而，在嚙齒動物中發現不一定需要在胚胎和子宮內膜之間直接接觸(Shiotani等，1993)。但二十年來胚胎植入率仍保持穩定及低下，我們可以說用陰道孕酮和hCG全身性施用及最后的17β雌二醇進行的內分泌處理遠未到達最佳而且完全未掌握胚胎植入過程的復雜的旁分泌學。
本發明提供了ART的一種新觀念，使用細胞包囊技術以植入細胞系，所述細胞系經遺傳學修飾而暫時在IVF程序中轉移胚胎之前在子宮內膜附近分泌目的分子。
這種比較接近靶組織的子宮內分子或“藥物”輸送，使得更好及更選擇性預處理子宮內膜及使用短半衰期的小分子或者使用具有不良反應而嚴禁在全身施用的分子。
根據第三方面，本發明涉及一種可植入/可插入型裝置，以將在植入之前在接受胚胎之前能預處理子宮的因子輸送至子宮壁或者治療子宮。關于這個實施方案，能刺激子宮特異性針對胚胎植入而準備的某些或大多數藥物，營養素，維生素，氨基酸，脂肪酸，肽，蛋白質等物質，或者任何其它治療劑，也可以通過本發明的含有釋放這些因子的聚合物或細胞的裝置而易于輸送。事實上，本發明的可取式子宮內裝置就藥物輸送而言對不能通過正常的注射或其它輸送途徑接受藥物的婦女具有特別的優勢。另外，通過子宮壁輸送因子可以是治療生殖系統癌癥和/或其它生殖疾病以及任何子宮疾病的最佳治療形式。
本發明特別提供了細胞包囊子宮內裝置以進行控制時間的體內和子宮內配子受精和/或胚胎植入前發育(從幾分鐘至48、72小時)，在此子宮在IVF程序中轉移指定胚胎之前發揮“天然培育器”的作用。
因此，本發明的細胞包囊子宮內裝置是一種新的及經改良的子宮內裝置，與Jerome Schwarz于1969年的美國專利No.3628530及ReneCoumut于1967年的美國專利No.3516403所述避孕IUD相似，其根據本發明可以使得將與其它體細胞相關或不相關的配子或胚胎(在體內共同培養)暫時導入子宮腔內，及在限定時間之后通過使用細胞包囊技術回收，如Thomas Mandel等于1989年的WO91/00119，Newman和Kram于2000年的WO01/64185 A2及Aebischer等于1990年的美國專利No.5158881和Li等于1996年的美國專利No.6054142所述。
事實上，本發明涉及一種可取式子宮內裝置以將一或多種能與子宮液相互作用的被包囊化(encapsulated)的因子放置在子宮腔內，其包括一種裝填包囊化的因子的子宮內裝置。
根據本發明，術語“因子”是指任何有機或無機的、細胞或分子、天然或合成的化合物或物質。
術語“裝填”不僅涵蓋了其中本發明子宮內裝置是所述被包囊化的因子的支持物，例如所述因子可附著于所述裝置的表面上，而且還包括其中所述因子包含在本發明的裝置內。根據優選的實施方案，提供的本發明可取式子宮內裝置具有至少一個腔(housing)，其中裝填了所述被包囊化的因子。不同的因子可以混合在相同的腔中或者置于單獨的腔中。
短語“能與子宮液相互作用”不僅涵蓋了其中所述因子通過本發明的裝置輸送至子宮液中以對子宮腔的壁(子宮內膜和/或子宮肌膜)產生作用(第一種情況)，還包括其中所述因子保持在所述裝置中并與子宮液和/或與子宮壁(子宮內膜和/或子宮肌膜)具有已知或未知的交換或相互作用(第二種情況)。
根據“第一種情況”的第一個方面，所述因子不僅是能治療子宮的制劑，而且還是能治療任何病變的制劑。事實上，能治療子宮的因子從本發明的裝置中輸送至子宮液中并對子宮腔壁具有直接作用。這種因子選自以下一組能預處理子宮壁以達到最佳植入胚胎的因子，能預處理子宮壁以達到最佳卵培養的因子，治療性處理子宮的因子及避孕制劑。
這種系統的優勢是使得可以使用對靶器官具有直接作用的因子，避免全身性途徑使用。
另外，根據“第一種情況”的第二個方面，本發明的裝置可以使得可以通過子宮內施用途徑輸送能治療任何病變的因子。換而言之，這種因子可以在子宮液內輸送，然后進入與子宮壁接觸并通過子宮內膜的靜脈系統之后進入全身血液系統。換而言之，該子宮內輸送是施用可能治療與任何器官有關的任何病變的任何藥物的一種可能途徑。
在可能裝填于本發明可取式子宮內裝置中的因子中，必須提及的有分泌一或多種因子的組織，細胞或細胞系(用于細胞治療)，體細胞，干細胞(全能細胞)，作為基因轉移載體的重組病毒(用于基因治療)，有義或反義mRNA序列，雄性和/或雌性配子，受精的卵母細胞(兩個前核細胞)，未受精的卵及任何上述因子的組合。
上述“第二種情況”涉及受精的卵母細胞(兩個前核細胞)和未受精的卵，其中子宮發揮天然培育器的作用，使得所述胚胎或卵在代替體外培養基的天然培養基中培養。在這種情況中，本發明的裝置中未裝填因子輸送至子宮液中，短語“與子宮液相互作用”涵蓋了胚胎或卵與由子宮液和子宮壁組成的環境培養基交換或相互作用。
根據本發明優選的實施方案，由組織，細胞或細胞系分泌的至少一種因子選自藥物，激素，營養素，肽，蛋白質，抗體，營養因子，生長因子，淋巴因子，細胞因子，酶，凝血因子，血管生成因子，神經遞質，神經調節因子。關于這一點，本發明涵蓋了其中分泌可裝填于本發明裝置中的因子的組織，細胞或細胞系可遺傳學修飾以獲得分泌希望的產物的情況。
根據本發明的另一個優選的實施方案，能治療性處理子宮的因子選自抗炎制劑，氨基酸，脂肪酸，抗體，營養因子，生長因子，淋巴因子，細胞因子，酶，蛋白質，肽，凝血因子，血管生成因子，止痛劑，神經遞質，神經調節因子，抗焦慮藥，抗抑郁藥，抗生素，有義或反義mRNA序列，作為基因轉移載體的重組病毒。
根據本發明的另一個實施方案，裝填于本發明可取式子宮內裝置中的因子能治療癌癥，各種生殖系統癌癥，生殖疾病及子宮疾病如子宮內膜炎，子宮內膜異位，子宮出血及各種感染(非限于所列出的疾病)。
事實上，本發明的裝置存在許多優勢所述裝置對子宮不可能造成任何問題，因為其不是植入子宮壁內，其不需要外科或麻醉以插入而且其可以以完全非固定的方式插入。另外，因子可以在自然月經周期階段及與控制藥物從所述裝置中輸送的激素依賴性基因表達系統結合而輸送。同樣非常重要的是應注意與經皮膚途徑施用同樣，子宮內施用使得可以避免施用的因子首先經過肝臟。這產生低毒性及所述因子存在較好的生物可利用度。最后，所述裝置可以使用外科介入而快速回收。


圖1例證了本發明裝置(1包囊，2支持帶A-遠端部分，支持帶B-近端部分，3活塞，4保護管，5開啟薄膜或瓣膜，6側翼，7移除裝置，8硅酮繩)。
例如，本發明的裝置包括1包囊·非生物可降解的·半通透的·聚合物材料(即聚醚砜或PES。來源于Akzo Nobel Faser AG，Wuppertal，德國)中空纖維如聚丙烯酸酯(包括共聚物)，聚乙烯，聚亞胺酯。
·孔適應于最佳環境性質，通透性從子宮液中存在的小至大分子。
·孔徑從0.005μm(等于截止分子量150kDa至280kDa)。
·孔結構微孔或任何適當的結構。
·外徑適應于通過宮頸進入子宮的導管的最佳規格(即700μm)。
·內徑適應于卵或胚胎的大小(即500μm)，卵或胚胎大小的大約5倍(人體具有放射冠的卵大小＝200μm)，或者適應于輸送的分子的大小·長度適應于子宮腔，避免子宮內膜損傷及由于子宮擴伸及最后其取出所致任何有害因素(即大約1.5cm)·根據上述要點采取圓柱形狀或適于子宮腔的任何適當形狀2兩個支持物，A帶(遠端)和B帶(近端)，如Schwarz的美國專利3628530針對IUD所述加以如下修改·遠端部分(A)由基于丙烯酸酯的膠，Luxtrack LCM 23(Ablestik，美國)或者任何其它系統如套帽密閉，近端部分(B)是中空及能打開的，具有一個有義方向(在內壁上)瓣膜·A帶支持物包括兩個側翼或者相似材料的任何其它裝置(其可以包括相似材料的不對稱側翼，與用薄親水性材料覆蓋支持物相比液面接觸更厚一些)或者使所述裝置穩定位于穩定子宮內其它支持物·B帶支持物包括一個系于取出線上的硅酮繩以回收所述裝置3.一個活塞
4.與活塞相連的一個操縱手柄5.一種取出纖維以取出子宮內包囊裝置6.一個附著裝置以附著取出纖維保證子宮內包囊裝置與活塞的固定位置7.一個環繞活塞的保護套管，如Lehtinen Matti等于1994年所述(專利號CZ 286 820)，但具有活塞使得IVF生物學家可以裝填配子，胚胎，藥物或具有標準移液管任何其它因子本發明的細胞包囊子宮內裝置可以采取任何形狀，其適應于使用合適微移液管裝填被包囊化的配子和/或胚胎或任何其它上述因子。優選的可植入胚胎培養裝置是具有合適孔徑的管狀選擇性可通透膜，以使得可以將足夠的營養素如O2，蛋白質，生長因子及子宮內膜釋放的其它已知和未知的因子移至胚胎中，具有一個末端，通過該末端可將配子或胚胎裝填于細胞區室中。然后控制側面末端然后用套帽永久閉塞，或者用環氧膠或生物適合的及不可再吸收材料如聚丙烯材料縫合線閉塞。
關于本發明可取式子宮內裝置的結構，內徑尺寸為100-10000微米的及具有將所述裝置附著于子宮腔(壁)的合適設施的一種可取式中空纖維裝置是子宮內培育卵/胚胎的理想場所。本發明應用的現行裝置是一種聚醚砜膜，MW截止為大約240000道爾頓，壁厚度為100微米，內徑為472微米。壁厚度根據成分，多孔性，水壓通透性，孔徑及包囊材料的強度可在50-500微米范圍內。分子量截止可在50000至＞1百萬分子量之間變化。另外，包囊材料可以由任何生物適合材料組成，包括聚醚砜，Pan-PVC或者擴展的PTFE及用層積或單一薄膜結構。包囊裝置可以含有或不含有一種基質或內襯材料。長度為0.5cm-5cm或者與子宮相適應。如上所述，針對這種裝置最重要的是其能在子宮內直接培育維持胚胎而不受損害，是完全可取式。另外，該裝置已經設計為很少或無組織反應，具有光滑表面，由此其可以植入或插入及回收而不誘導炎癥或纖維化反應或者不適當的子宮壁組織損害或者瘢痕。最后，該裝置設計為其具有一種保留在子宮內的設施(即小縫合線膠粘于所述裝置的頂端以附著于子宮內或外)而且在植入子宮后任何時間均可易于回收(附著于縫合線)。與Modex治療(PES 5，PES 1，PES 10/10)現行使用的那些中空纖維裝置及細胞治療(Pan-PVC)過去使用的裝置成分相似的裝置，針對這種應用是理想的，盡管符合這種一般描述的任何裝置均適于使用。
本發明的裝置可以經外科操作作為避孕的標準IUD通過子宮頸植入子宮內及在指定培育時間之后取出。
然而，通過修改本發明細胞包囊子宮內裝置，使得本發明還可在輸卵管部位植入，例如修改為沒有具有兩翼的遠端部分。這種植入更難以達到而且需要使用外科方法，如在全身麻醉下使用腹腔鏡或者在局部麻醉下使用陷凹鏡。這種體內輸卵管內胚胎培育與GIFT或ZIFT相似，除了使用本發明細胞包囊裝置可以控制培育時間及裝填的胚胎可以不限制數目，可以對其加以回收并在一個簡便的沖洗程序之后選擇移植。
因此，在使用或不使用ICSI的標準IVF之后，可以用標準微移液管將不同階段的(2-5天)合子或胚胎裝填入本發明的細胞包囊子宮內裝置中。
本發明還涉及一種制備可取式子宮內裝置以放置一或多個因子的方法，所述因子能與子宮液相互作用，所述方法包括以下步驟-提供被包囊化的合適形式的所述因子，-提供適于接受被包囊化的因子的一種可取式子宮內裝置-用所述因子裝填所述裝置。
本發明還涉及一種放置一或多個放置因子的方法，所述因子能與子宮液相互作用，所述方法包括以下步驟-提供一種可取式子宮內裝置，-將所述裝置植入子宮腔內一定時期。
根據本發明優選的實施方案，在哺乳動物子宮腔內進行上述方法，所述動物優選選自牛，綿羊，豬和人。
更特別地，本發明可以根據以下方法進行A.體內受精在包囊裝置中注入準備的精子和可重新獲得的卵母細胞以植入子宮內。在體內及子宮內培養的指定及控制的培育時間后(2小時)，回收被包囊化的精子和卵母細胞，在簡單的沖洗程序之后收集合子和/或未受精的卵母細胞。在第3天選擇合子低溫貯藏或者移植剩余的胚胎的體外培養物。
B.體內植入前胚胎發育將準備的精子和可重新獲得的卵母細胞在體外受精。在控制的時期內(即48小時)，將不同發育階段的一些胚胎(即6-8個細胞)注入可以植入子宮腔內的細胞。在從子宮中取出包囊系統裝置后，將卵泡階段的胚胎從該裝置中取出沖洗，使用常規轉移管移至子宮腔內或者在冷凍之后延期在下一個周期中。
C.體內胚胎輔助孵化近來已經表明在體外程序中充分研究和描述的卵泡孵化方法已經在嚙齒動物中錯誤接受，表示一種自然情況(Gonzales等，2001)。確實，在倉鼠物種中子宮在體內有助于卵泡脫掉由子宮分泌的蛋白質組成的透明帶，這似乎是在子宮內透明帶脫失的主要機制，而在體外溶胞活性對滋養外胚層的侵襲行為是次要的。
考慮到這種令人驚奇的經過，使用本發明的子宮內細胞包囊裝置暫時培育胚胎的本發明方法可以用于進行一種新的輔助孵化方法體內胚胎輔助孵化。
在這個基礎上，使用本發明的細胞包囊裝置在體內和子宮內控制時間地培養配子和/或植入前胚胎，使得在胚胎-母體界面的真實對話具有來自子宮內膜的(或者在輸卵管內植入的情況中來自輸卵管)的一些已知但也未知的因子旁分泌作用及最佳發育的胚胎可以使ART程序中的植入過程更成功。
其它科學家已經描述了配子或胚胎包囊化(Loi等，1992；Nebel等，1993)。然而，他們均使用生物可降解的材料(藻酸鈉)并具有消除與胚胎移植程序相關的一些問題(創傷)和在植入之前改善胚胎保護及保護胚胎的游離透明帶(Cosby等，1990；Adaniya等，1993)。
本發明人的最佳見解是本發明中描述的通過使用本發明的包囊裝置自然培育配子和/或胚胎的新觀點從未由科學家公布或提議。
本發明還提供了一種使用通過基因轉染而遺傳學修飾的細胞系的細胞包囊裝置以植入子宮腔內的方法，這種方法在本發明之前從未由科學家公布，所述基因轉染如Kopchick等于1984年的美國專利No.4686098及Aebischer等于1987年的美國專利No.4892538所述。
上述這種新裝置使得可以將分子從子宮腔輸送至子宮內膜而無全身作用，及可以在ART中體外受精或自然受精之后在胚胎移植之前改變和準備更特異性的子宮內膜，或者可以相反地作為IUD避免任何方式妊娠(抗植入，抗受精)。
將生物活性因子輸送入子宮腔內的這種新觀念可以更好地理解對子宮內膜組織的特異性旁分泌作用，及可以在不遠的將來揭示一種新的及加以補充的細胞治療方法以調節和準備在ART中胚胎植入所需的子宮內膜。
實施例1在小鼠模型中的體內和子宮內胚胎培養這個實驗的目的是評價使用改良的半通透的中空纖維作為包裝進行體內和子宮內植入前胚胎發育的能力。
對在4-6周齡的青春期前雌性小鼠使用卵巢刺激方案獲得合子，所述方案是相應于在程序第一天經腹膜內注射使用5U PMSG(Folligon，Veterinaria)及在第三天在17:00腹膜內注射使用5IU人絨毛膜促性腺激素(Choluron，Veterinaria)，間隔48小時以誘導超排卵。
將雌性小鼠與CBAxC57B1雄性小鼠在注射HCG(第三天)套籠交配。
在雄性與雌性小鼠套籠交配后第5天收集6-8個細胞階段的胚胎，在體內培養(1組)或者在體外用貫序培養基培養(2組)。只對兩個具有交配孔栓(plug)的雌性小鼠進行操縱并用于這個實驗中。
將雌性小鼠通過頸部脫位處死并進行剖腹手術以取出子宮角和輸卵管以收集胚胎。
在第3天將6-8個細胞階段的胚胎移至兩個假妊娠雌性小鼠(受體)的左角或右角。
將1組胚胎(體內培養)裝填于本發明經修改的中空纖維裝置中(半通透的聚醚砜(PES)中空纖維，得自Akzo Nobel Faser AG，Wuppertal，德國)，所述中空纖維外徑＝680μm，內徑＝480μm，長度＝0.5cm，附于一個6.0號無菌不可再吸收手術線上，使用細玻璃移液管在顯微鏡觀察下進行裝填。
根據標準程序在乙醚麻醉下進行背部剖腹手術，以取出右側或左側子宮角并將具有被包囊化的合子的子宮內裝置植入右角或左角的內腔中。
在經手術固定具有被包囊化的合子的子宮內裝置后，將所述子宮角再放置入其解剖部位，使用鉤子以閉合皮膚。
在48小時后，將移植的雌性小鼠通過頸部脫位處死，進行剖腹手術以取出含有子宮內裝置的左角和右角并回收所述裝置。
在切下所述裝置的兩個遠端部分后收集胚胎，用培養基沖洗包囊化腔。表1示出兩個實驗的結果，對比了在48小時培養后6-8個細胞階段的胚胎在體內和體外(對照)的發育。
在1組中，所有被包囊化的6-8個細胞的胚胎在子宮內與在對照組中相似持續發育。然而，與體外胚胎培養相比注意到發育延遲。
這個實施例首次揭示了具有被包囊化的胚胎的子宮內裝置可以使得其在子宮內自然培育，至少與常規在體外培養的發育相似。
從可獲得的文獻中，曾經認為IUD與生殖是相對立的及總是與避孕相關的。在子宮腔內存在外源體已知在所有物種中均干擾生殖。然而，受影響的生殖過程的步驟在文獻中還未清楚。似乎其可以根據物種的變化而改變。一般認可的是IUD誘導子宮內膜局部炎癥反應。而在小鼠和大鼠中，這種多形核細胞的慢性侵潤似乎與細菌感染相關及將子宮內膜轉化為具有胚胎毒性分泌因子的對立環境(Parr等，1967)，20年，Alvarez等(1988)揭示了在婦女中在胚泡進入子宮腔之前IUD可影響受精。
上述結果表明小鼠胚胎無退化發育與一般認可的學術觀點相對立，所認可的觀點是在動物模型中子宮自身通過釋放一些毒性因子而殺死胚胎。
在體內被包囊化的胚胎中示出的發育延遲可以解釋為孔或內腔直徑的大小不合適，導致其周圍營養素濃度較低。另外，在體內培養之前在室溫將具有被包囊化的胚胎的IUD植入子宮內的時間，有時是幾分鐘，可以解釋對植入前胚胎的熱和gazous休克的有害作用。
實施例2子宮內促紅細胞生成素輸送使用經修改和發明的包囊化的分泌小鼠Epo的小鼠C2C12細胞在子宮內輸送促紅細胞生成素(Epo)，降低子宮內膜中細胞程序死亡及提高血液血細胞比容，這提示EPO對鄰近的子宮內膜組織的直接作用及從子宮中輸送Epo的全身作用。
促紅細胞生成素在成人由腎產生，在胎兒由肝產生。其是調節紅細胞生成的重要因子，通過刺激晚幼紅細胞增殖和分化而起作用。近來已經示出腦具有一種旁分泌Epo/EpoR，Epo可以在腦缺血后防止神經細胞程序死亡(Siren等，2001)。令人感興趣地地，Epo似乎與子宮血管生成相關。
考慮到Epo的上述生理學作用，通過測定血液血細胞比容評價使用本發明的細胞包囊裝置從子宮輸送Epo對子宮內膜的作用，及評價子宮腔內該裝置的新植入部位的細胞存活性。
將小鼠C2C12成肌細胞用含有小鼠Epo cDNA和突變的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的質粒轉染，在施用增加劑量的氨甲蝶呤的基礎上進行基因擴增。
將分泌Epo的細胞系裝填于聚醚砜小孔中空纖維中，以植入子宮腔內。這種新發明的細胞包囊裝置的特點與實施例1所述相似。
在本實驗中使用共14個裝置以盲試形式植入，1組具有Epo分泌作用mEpo-C2C12(n＝7)，2組無Epo分泌作用mEpo-C2C12對照細胞(n＝7)。
在第14天，根據處死動物的標準認可方案，取出子宮和回收包囊裝置以進行mEpo輸出脈沖。將子宮固定于10％甲醛中，進行免疫組織化學和TUNEL分析測試細胞程序死亡。
與無Epo輸送的2組(45.7±2.9)相比，具有子宮內Epo輸送的1組的血液血細胞比容明顯提高(59.4±6.8)。注意到在14只雌性小鼠中在子宮內輸送Epo 14天后p≤0.005(數據未示出)。
注意到Epo與最近描述的其在神經細胞中的作用相似，降低子宮內膜組織中細胞程序死亡。
子宮內膜因此是Epo一種新靶位，具有細胞程序死亡的調節作用。
被包囊化入微孔中空纖維內的轉染的細胞系在子宮內培育14天后是可存活的，其在之前從未作為細胞包囊裝置的植入部位進行實驗。
由轉染的細胞系分泌的Epo穿過該裝置的微孔壁并通過子宮內膜吸收及通過全身循環，明顯提高處理動物血液血細胞比容。
這些結果證實i)通過實施例1的結果證實子宮可以是胚胎附于的良好天然培育器，ii)可以使用婦女或雌性動物的子宮腔作為細胞包囊系統的植入部位進行藥物輸送。
表1
*早期胚泡，在包囊沖洗兩個胚胎后不可回收×1早期胚泡，1胚胎喪失參考文獻Adaniya GK，Rawlins RG，Quigg JM，Roblero L，Miller IF，Zaneveld Firstpregnancies andlivebirths from transfer of sodium alginate encapsulatedembryos in a rodent model.L J Fertil Steril 1993 59652-6.
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1.一種用于將一或多種能與子宮液相互作用的被包囊化的因子放置在子宮腔內的可取式子宮內裝置，其包括一種裝填了所述被包囊化的因子的子宮內裝置。
2.權利要求1的可取式子宮內裝置，其中所述裝置具有至少一個腔，其中裝填所述被包囊化的因子。
3.權利要求1或2的子宮內裝置，其中所述因子選自包含以下物質的一組-能處理子宮的因子，-能治療任何病變的因子，-分泌一或多種因子的組織，細胞或細胞系，-體細胞，-干細胞，-作為基因轉移載體的重組病毒，-有義或反義mRNA序列，-雄性和/或雌性配子，-受精的卵母細胞，-未受精的卵，及其任意組合。
4.權利要求3的可取式子宮內裝置，其中所述能處理子宮的因子選自包含以下物質的一組-能預處理子宮壁以進行最佳胚胎植入的因子，-能預處理子宮壁以進行最佳卵孵化的因子，-能治療性處理子宮的因子，-避孕制劑。
5.權利要求3的可取式子宮內裝置，其中由組織，細胞或細胞系分泌的至少一種因子選自包含以下物質的一組藥物，激素，營養素，肽，抗體，營養因子，生長因子，淋巴因子，細胞因子，酶，凝血因子，血管生成因子，神經遞質，神經調節因子。
6.權利要求4的可取式子宮內裝置，其中能治療性處理子宮的因子選自包含以下物質的一組抗炎劑，氨基酸，脂肪酸，抗體，營養因子，生長因子，淋巴因子，細胞因子，酶，蛋白質，肽，凝血因子，血管生成因子，止痛劑，神經遞質，神經調節因子，抗焦慮藥，抗抑郁藥，抗生素，有義或反義mRNA序列，作為基因轉移載體的重組病毒。
7.權利要求3的可取式子宮內裝置，其中所述的至少一種因子是由經遺傳學修飾的組織，細胞或細胞系分泌的。
8.前述任何權利要求的可取式子宮內裝置，其中所述因子能治療癌癥，各種生殖系統癌癥，生殖疾病及子宮疾病如子宮內膜炎，子宮內膜異位，子宮出血及各種感染。
9.一種制備用于將一或多種能與子宮液相互作用的被包囊化的因子放置在子宮腔內的可取式子宮內裝置方法，包括以下步驟-提供適合被包囊化的形式的所述因子，-提供一種適于接受一或多種被包囊化因子的可取式子宮內裝置，-將所述一或多種因子裝填入所述裝置中。
10.一種用于將一或多種能與子宮液相互作用的被包囊化的因子放置在子宮腔內的方法，包括以下步驟-提供權利要求1-6中任一項所述的一種可取式子宮內裝置，-將所述裝置植入子宮腔內持續一定時間。
11.權利要求10的方法，其中將至少一種被包囊化的因子置于哺乳動物的子宮腔內。
12.權利要求10或11的方法，其中所述哺乳動物選自包含以下動物的一組牛，綿羊，豬，馬和人。
全文摘要
一種用于將一或多種能與子宮液相互作用的被包囊化的因子(1)放置于子宮腔內的可取式子宮內裝置，其包括一種裝填了所述的被包囊化的因子(1)的子宮內裝置。
文檔編號A61B17/435GK1561186SQ02819398
公開日2005年1月5日 申請日期2002年7月22日 優先權日2001年8月1日
發明者帕斯卡爾·莫克 申請人:帕斯卡爾·莫克