專利名稱：尖吻蝮蛇凝血酶及其分離方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質分離純化技術領域，具體而言，本發明涉及尖吻蝮蛇凝血酶的分離方法以及其分離的尖吻蝮蛇凝血酶。
背景技術：
尖吻蝮蛇的凝血酶是我國自主開發的一種蛇毒類凝血酶，通常由A、B兩個亞基構成，能夠激活體內的凝血因子而用于止血，從而可以在臨床上代替進口藥物“立止血”(Reptilase)0目前國內已經有一系列尖吻蝮蛇凝血酶及其分離提取方法被報道。例如，中國專利99116406公開了從尖吻蝮蛇中提取凝血酶的方法，其依次用葡聚糖凝膠G-75柱、DEAE-葡聚糖凝膠A-50柱、CM-葡聚糖凝膠C-50柱以及SuperdeX-75PG柱純化，最終獲得 的凝血酶的等電點為4. 5-5. O。中國專利01108029公開了從尖吻蝮蛇中提取凝血酶的方法，其依次用DEAE層析柱、Mono Q層析柱以及RESOURCE RPC柱純化，最終獲得的凝血酶的分子量為30298Da，另外確定了部分氨基酸序列。中國專利01115567公開了從尖吻蝮蛇中提取的凝血酶，經過兩次陰離子交換層析和脫鹽步驟得到，并確定了其全部氨基酸序列。中國專利01115570公開了一種從尖吻蝮蛇中提取的凝血酶，經過兩次陰離子交換層析和脫鹽步驟得到，并確定了其全部氨基酸序列。中國專利03140154公開了從尖吻蝮蛇中提取的凝血酶，不清楚其具體純化過程，最終獲得的凝血酶的分子量為29076Da，另外僅僅確定了部分氨基酸序列。中國專利01115570公開了一種從尖吻蝮蛇中提取的凝血酶，依次經過兩次DEAE-Sepharose FF層析和S印hadex G_25脫鹽步驟得到，最終獲得的凝血酶的分子量為29. 3^29. 5kDa，并確定了其部分氨基酸序列。中國專利200910214396公開了一種從尖吻蝮蛇中提取的凝血酶，然而該凝血酶
是單鏈凝血酶。本發明人經過長期艱苦研究，摸索了一種新的從尖吻蝮蛇中提取凝血酶的方法，能夠高效、低成本地提取高純度的凝血酶，更令人意外地發現了新的尖吻蝮蛇凝血酶，其凝血酶活性較高。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于提供新的提純尖吻蝮蛇凝血酶的方法以及其所提純得到的新的凝血酶。具體而言，在第一方面，本發明提供了制備尖吻蝮蛇凝血酶的方法，其包括
(I)將尖吻蝮蛇蛇毒溶液上樣于分子篩凝膠層析柱，用PH6. 5^7. 8的緩沖液洗脫，收集具有最強凝血酶活性的峰的洗脫液；(2)將步驟(I)獲得的洗脫液上樣于陰離子交換層析柱，以含0-0.IM NaCl的pH
7.2-8. 2的緩沖液洗脫，收集具有最強凝血酶活性的峰的洗脫液；和
(3)將步驟(2)獲得的洗脫液上樣于分子篩凝膠層析柱，用水洗脫，收集具有最大峰面積的峰的洗脫液，任選將其進一步冷凍干燥。由于陰離子交換層析柱更為昂貴，而本發明的方法的步驟中僅有一個步驟使用了陰離子交換層析柱，而且不包含透析等耗時的步驟，因此能夠高效、低成本地提取尖吻蝮蛇凝血酶，而且提取的純度達到藥用純度標準。優選在本發明第一方面的方法中，步驟(3)獲得的洗脫液(或冷凍干燥的凍干粉)中的尖吻蝮蛇凝血酶的純度大于95%，優選大于96，％，更優選大于97%，如大于97. 5%。盡管采用的制備步驟組合完全不同于現有技術，然而每一步驟中所使用的層析柱以及試劑可以采用本領域技術人員能夠獲得的技術，包括市售的產品。優選在本發明第一方面的方法中，步驟(I)中，分子篩凝膠層析柱是S印hadex G-75層析柱。也優選步驟(I) 中，緩沖液的PH值是7. (Γ7. 5，優選是7. 2。還優選步驟(I)中，緩沖液是PBS緩沖液。優選在本發明第一方面的方法中，步驟(2)中，陰離子交換層析柱是DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱。也優選步驟(2)中，緩沖液的pH值是7. 5 8. O,優選是7. 8。還優選步驟(2)中，緩沖液是PBS緩沖液。另外優選在本發明第一方面的方法中，步驟(3)中，分子篩凝膠層析柱是SephadexG-75層析柱。盡管步驟(I)和(3)可以使用相同的層析柱，然而用于洗脫的試劑不同，本發明人研究發現，對于特定的洗脫液體系，步驟(I)中慢速洗脫會有更高的分辨率，而步驟(3)則洗脫速度沒有顯著的影響。因此，優選在本發明第一方面的方法中，步驟(I)中洗脫的流速慢于步驟(3)中洗脫的流速,例如,步驟(I)中洗脫的流速為l 3mL/min,優選為2mL/min ；而步驟(3)中洗脫的流速為4 8mL/min,優選為6mL/min。本發明人還發現了一種新的尖吻蝮蛇凝血酶，其甚至在低劑量下比市售的“立止血”(R印tilase)的止血功效還顯著。優選在本發明第一方面的方法中，尖吻蝮蛇凝血酶包含氨基酸序列分別如SEQ ID No :1和2所示的兩個亞基，更優選其由兩個亞基組成，這兩個亞基的氨基酸序列分別如SEQ ID No :1和2所示。在第二方面，本發明提供了尖吻蝮蛇凝血酶，其包含兩個亞基，這兩個亞基的氨基酸序列分別如SEQ ID No :1和2所示。該酶可以是通過本發明第一方面的方法制備的，也可以是通過DNA重組技術制備的。優選本發明第二個方面的尖吻蝮蛇凝血酶由兩個亞基組成，這兩個亞基的氨基酸序列分別如SEQ ID No :1和2所示。在第三方面，本發明提供了編碼本發明第二方面所述的尖吻蝮蛇凝血酶的基因。該基因可以是DNA，也可以是RNA。根據DNA重組技術，根據已知的氨基酸序列可以容易地設計出基因，導入合適的宿主細胞表達，即可獲得該尖吻蝮蛇凝血酶。在第四方面，本發明提供了包含本發明第三方面所述的基因的載體，優選是表達載體，尤其是動物細胞表達載體，最優選是蛇細胞表達載體。當前已經有許多載體商品化了，可通過轉化、轉染或者其他基因重組手段可以將本發明第三方面所述的基因導入載體中。在
在第五方面，本發明提供了轉化或轉染了本發明第四方面所述的載體的宿主細胞，優選是動物細胞，最優選是蛇細胞。該宿主細胞可用于表達本發明第二方面所述的尖吻蝮蛇凝血酶。在第六方面，本發明提供了用于止血的藥物組合物，其包括本發明第二方面所述的尖吻蝮蛇凝血酶和藥學上可接受的載體。在本文中，“藥學上可接受的載體”指無毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、佐劑、包裹材料或其他制劑輔料。根據本領域的公知技術，可以根據治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型，優選該組合物為單位劑量形式，如片劑、膜劑、丸劑、膠囊(包括持續釋放或延遲釋釋設形式)、粉劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑和乳液劑、消毒的住射用溶液或懸浮液、氣霧劑或液體噴劑、滴劑、針劑、自動注射裝置或栓劑。在第七方面，本發明提供了本發明第二方面所述的尖吻蝮蛇凝血酶在制備用于止血的藥物中的應用。本發明的藥物可通過所屬領域技術人員所熟知的給藥方式來進行給藥，例如口服、直腸、舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內給藥。本發明的藥物組合物優 選胃腸道外給藥，如皮下、肌內或靜脈內注射。給藥劑量根據制劑形式和期望的作用時間以及治療對象的情況而有所變化，實際治療所需的量可以由醫師根據實際情況(如，病人的病情、體重等)而方便地確定。對于一般的成人，本發明的藥物的劑量，以本發明第二方面所述的尖吻蝮蛇凝血酶計，每kg成人(一般為60kg)體重可以是lng-lg,優選是IOng-IOmg,更優選是IOOng-IO μ g,例如是200ng_5 μ g。本發明具有以下有益效果本發明的制備方法方便有效，成本較低而且耗時較短，提取的尖吻蝮蛇凝血酶純度達到甚至超過藥用要求；本發明的尖吻蝮蛇凝血酶活性高，在μg級水平即可產生顯著的止血作用。為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重復敘述過一樣。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明的內容。如未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實驗指南(第3版)》(科學出版社)以及相應儀器和試劑的廠商說明書等參考。實施例I尖吻蝮蛇凝血酶的提純
取IOg尖吻蝮蛇蛇毒凍干粉(可購自南寧市綠化古潭養蛇場)，溶解于50mL IOmM PBS緩沖液(pH7. 2)中，3500rpm離心IOmin后上樣于Sephadex G-75層析柱(可購自Pharmacia公司)，用IOmM PBS緩沖液(pH7. 2)以2mL/min的流速緩慢洗脫，依次分別收集各個洗脫峰并測定凝血酶活性，發現洗脫的第5個峰具有最強的活性，因此保留該峰的洗脫液，即為提取液I。將提取液I上樣于DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱(可購自GE Healthcare公司)，以含0-0. IM NaCl的IOmM PBS緩沖液(ρΗ7· 8)進行梯度洗脫，依次分別收集各NaCl濃度的洗脫峰并測定凝血酶活性，發現O. 08Μ NaCl洗脫的峰具有最強的活性，因此保留該峰的洗脫液，即為提取液2。將提取液2上樣于Sephadex G-75層析柱(可購自Pharmacia公司),用去離子水以6mL/min的流速洗脫，收集其中最大的洗脫峰，其具有凝血酶活性，即為本發明的尖吻蝮蛇凝血酶，可進一步了冷凍干燥。實施例2新的尖吻蝮蛇凝血酶的鑒定
將實施例I獲得的尖吻蝮蛇凝血酶分別進行1) SDS-PAGE檢測，發現其由分子量分別為約15kDa和14kDa，面積歸一化法測量的純度為97. 8%，達到藥用純度標準；2)進行飛行時間質譜測定，發現分子量為29109Da，表明這可能是一種新的尖吻蝮蛇凝血酶；3)對凝血酶進行糖測定，發現該酶含有2. 17% (W/W)的中性己糖，表明這是在一種糖蛋白，其中非糖蛋白的分子量約為28. 5kDa，預計發現了新的蛋白質一級結構。我們通過商業途徑委托上海生工生物技術有限公司對實施例I獲得的尖吻蝮蛇 凝血酶的凍干粉進行氨基酸序列分析，發現兩個亞基的氨基酸序列分別如SEQ ID No:l和2所示，經檢索，證實了是新的尖吻蝮蛇凝血酶。實施例3新的尖吻蝮蛇凝血酶的活性測定
取實施例I獲得的尖吻蝮蛇凝血酶的凍干粉，以市售的“立止血”(Iteptilase)為陽性對照，以生理鹽水為陰性對照，對小鼠分別靜脈給藥后30min，在距離小鼠尾部尖端O. 5cm處剪斷，觀測各藥物對小鼠減尾出血時間的降低作用。其結果如表I所示，本發明的尖吻蝮蛇凝血酶和“立止血”均對陰性對照有顯著的抑制出血作用，可以有效降低減尾出血時間，本發明的尖吻蝮蛇凝血酶的作用呈現出一定的量效相關性，尤其有效的是，低劑量的本發明的尖吻蝮蛇凝血酶的即可具有與市售產品相當的止血作用。表I各藥物對小鼠減尾出血時間的降低作用
分·I給藥劑量出■時間(.s>
本發明低劑量組 I
本發明申劑貴IfiWfirkgW.3±U+"
__13 .61.*
_性對靜.續I-JO. 5±2 6
陽性對 MIV5.V:1;214 2+19,l
I ~ 畫"-_t-.................................... ....................
**表示相對于陰性對照組，P〈0.01。
權利要求
1.制備尖吻蝮蛇凝血酶的方法，其包括 (1)將尖吻蝮蛇蛇毒溶液上樣于分子篩凝膠層析柱，用PH6.5^7. 8的緩沖液洗脫，收集具有最強凝血酶活性的峰的洗脫液；(2)將步驟(I)獲得的洗脫液上樣于陰離子交換層析柱，以含0-0.IM NaCl的pH7.2-8. 2的緩沖液洗脫，收集具有最強凝血酶活性的峰的洗脫液；和 (3)將步驟(2)獲得的洗脫液上樣于分子篩凝膠層析柱，用水洗脫，收集具有最大峰面積的峰的洗脫液，任選將其進一步冷凍干燥。
2.權利要求I所述的方法，其中步驟(I)中，分子篩凝膠層析柱是SephadexG_75層析柱；緩沖液的PH值是7. (Γ7. 5，優選是7. 2 ;和/或，緩沖液是PBS緩沖液。
3.權利要求I所述的方法，其中步驟(2)中，陰離子交換層析柱是DEAE-SepharoseFast Flow層析柱；緩沖液的pH值是7. 5 8. 0，優選是7. 8 ;和/或，緩沖液是PBS緩沖液。
4.權利要求I所述的方法，其中步驟(3)中，分子篩凝膠層析柱是SephadexG_75層析柱。
5.權利要求I所述的方法，其中步驟(I)中洗脫的流速慢于步驟(3)中洗脫的流速。
6.權利要求I所述的方法,其中尖吻蝮蛇凝血酶的純度大于95%，優選大于96，％，更優選大于97%，如大于97. 5%。
7.權利要求I所述的方法，其中尖吻蝮蛇凝血酶包含氨基酸序列分別如SEQID No 1和2所不的兩個亞基。
8.尖吻蝮蛇凝血酶，其包含氨基酸序列分別如SEQID No :1和2所示的兩個亞基，優選其是由權利要求Γ7所述的方法制備的。
9.用于止血的藥物組合物，其包括權利要求8所述的尖吻蝮蛇凝血酶和藥學上可接受的載體。
10.權利要求8所述的尖吻蝮蛇凝血酶在制備用于止血的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了尖吻蝮蛇凝血酶的制備方法以及其分離的尖吻蝮蛇凝血酶。所述制備方法依次包括分子篩凝膠層析柱、陰離子交換層析柱和分子篩凝膠層析柱純化。所得的尖吻蝮蛇凝血酶純度高，止血效果好。另外，本發明還提供了該尖吻蝮蛇凝血酶的藥物組合物及止血用途等。
文檔編號A61P7/04GK102757948SQ201210167568
公開日2012年10月31日 申請日期2012年5月28日 優先權日2012年5月28日
發明者徐丹 申請人:廣東瑞昇藥業有限公司