專利名稱：一種十七肽的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種十七肽的醫(yī)藥用途，特別是涉及該十七肽用于治療神經(jīng)元退行性變的新用途。
所述十七肽是體內(nèi)存在的稱為β-淀粉樣肽前體蛋白肽鏈中第319-335位的肽段，由17個氨基酸組成，其序列是丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-精氨酸-亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-賴氨酸-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-精氨酸-蛋氨酸-絲氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蛋氨酸。(AKERLEAKHRERMSQVM)。國外在90年代中期發(fā)現(xiàn)APP17肽具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，包括促進(jìn)軸突生長、增加突觸密度、能保護(hù)缺血引起的神經(jīng)元損傷，但未見有關(guān)APP17肽治療神經(jīng)元退行性變的報道。
神經(jīng)元退行性變包括一類原因不明的疾病，如老年性癡呆、帕金森氏病、運(yùn)動元疾病和其它一些疾病。另一類為病因較明確的疾病引起神經(jīng)元退變，如糖尿病和腦血管疾病。但無論病因明確與否，目前的臨床上無針對神經(jīng)元退行性變的藥物。例如對老年性癡呆應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑，帕金森氏病給以多巴胺等或控制原發(fā)病變(控制糖尿病和改善供血)為主要手段，因此現(xiàn)有的藥物不能真正有助于神經(jīng)元退行性變的恢復(fù)。當(dāng)前，國際上研究治療神經(jīng)元退行性變，主要著眼于神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的開發(fā)，應(yīng)用一些研究表明這些因子可能對外周神經(jīng)病變有一定效果，但因不能通過血腦屏障而對中樞神經(jīng)退行性變?nèi)狈χ委熜Ч?br> 本發(fā)明是目的是要開發(fā)一種新的治療神經(jīng)元退行性變的藥物。近年來我們對APP17肽進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。我們的研究證實APP17肽在體外能增加神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞胞體面積和軸突生長的長度。我們研究工作主要應(yīng)用三種神經(jīng)元退行性變的模型(糖尿病小鼠、去卵巢大鼠和半乳糖老化小鼠)，觀察模型動物的行為學(xué)(水迷宮)、海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)和30多種與神經(jīng)元退行性變有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)。研究表明這些動物模型存在海馬神經(jīng)元的退行性改變，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶障礙、神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)異常，蛋白質(zhì)表達(dá)異常為tau蛋白過度磷酸化、Aβ增加、多種神經(jīng)營養(yǎng)因子減少。APP17肽對這些改變具有明顯的預(yù)防和治療作用，無論在造模同時給藥(皮下注射)或造模后若干星期給藥均有同樣效果。APP17肽對糖尿病外外周神經(jīng)病變同樣具有明顯作用，在體外實驗中，APP17肽可促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、神經(jīng)絲蛋白和胰島素降解酶的表達(dá)，并能使基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞Aβ的分泌減少。APP17肽還有保護(hù)谷氨酸和高糖對神經(jīng)元的損傷作用。由于APP17肽分子量小，皮下給藥能明顯改善海馬神經(jīng)元退行性變。因而我們發(fā)現(xiàn)了APP17肽能治療人神經(jīng)元退行性疾病的新醫(yī)藥用途。
將APP17肽用于治療神經(jīng)元退行性疾病有如下優(yōu)點1)它本身就是神經(jīng)營養(yǎng)因子。
2)能使多種神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)增加。
3)對不同病因(胰島素和雌激素缺乏性神經(jīng)系統(tǒng)病變、氧化應(yīng)激神經(jīng)元損傷)引起的神經(jīng)元退變均有治療作用，說明是一種“廣譜”抗神經(jīng)退變的多肽。
4)皮下注射能治療腦神經(jīng)元退行性變。
5)APP17肽是β-淀粉樣肽前體蛋白N端中的一段17肽，所以它的序列存在于體內(nèi)，而且分子量小(約1900)，不會引起過敏反應(yīng)。
6)成本低、多肽質(zhì)量有保證。
本發(fā)明APP17肽采用已知的肽合成方法固相合成法合成。固相肽合成的主要思想是先將所要合成肽鏈的羧基末端氨基酸的羧基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子化合物(樹脂)相連接，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份，經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組份反應(yīng)，接長肽鏈。這樣的步驟可以反復(fù)地多次進(jìn)行下去，最后達(dá)到所需要合成的肽鏈的長度。下式表示了這個合成過程。
原料HMP resin(p-羥甲基苯氧甲基多聚乙烯樹脂)Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保護(hù)的氨基酸)NMP氮甲基吡咯烷DCM二氯甲烷甲醇哌啶DMAP二甲基氨基吡啶HOBt羥基苯并三唑DCC二環(huán)已基碳二亞胺TFA三氟乙酸EDT1,2-乙二硫醇硫代苯甲醚結(jié)晶苯酚乙腈儀器多肽自動合成儀(美國ABI431A型)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Yamato,RE50)高效液相色譜儀(美國PE151A型)冷凍干燥機(jī)合成方法稱取HMP樹脂100mg，取代當(dāng)量是1.0meq，即0.1mmol于美國ABI431A型多肽自動合成儀的反應(yīng)腔內(nèi)，由合成儀自動將特定的AA按不同的順序連接起來，偶聯(lián)率達(dá)99％反應(yīng)如下1．氨基酸的活化(HOBt/DCC法) Fmoc保護(hù)的氨基酸 2．聯(lián)接氨基酸到樹脂上 HOBt活性酯3．脫去氨基酸的Fmoc保護(hù)基 4．氨基酸的活化(HOBt/DCC法) 5．偶聯(lián) 新的偶聯(lián)的肽-樹脂
AKERLEAKHRERMSQVM-樹脂450mg將肽鏈從樹脂上切落用TFA(三氟乙酸)切割肽鏈，用EDT，硫代苯甲醚，H2O作清除劑，在室溫下反應(yīng)3.0小時，除去切割試劑，再用乙醚萃取，得到APP17肽的粗品為180mg，收率為85％。APP17肽的純化高效液相色譜分離純化條件 色譜柱 C810×100mm色譜儀 ABI 151A型 美國流動相 A-0.1％TFA(三氟乙酸)H2OB-0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈檢測波長 214nm流速 4ml/分鐘洗脫梯度 20-60％B于30分鐘HPLC(高效液相色譜)分析色譜柱 C184.6×150mm流動相 A-0.1％TFA(三氟乙酸)H2OB-0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈檢測波長 214nm流速 1ML/min洗脫梯度 0-60％B于30分鐘HPLC分析結(jié)果見附圖9．APP17肽的鑒定序列丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-精氨酸-亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-賴氨酸-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-精氨酸-蛋氨酸-絲氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蛋氨酸APP17肽氨基酸組份分析結(jié)果見附

圖10。
以Ala做標(biāo)準(zhǔn)2.288
注1．Gln(谷氨酰胺)在酸解過程中被破壞變?yōu)镚lu(谷氨酸)，所以Glu(谷氨酸)為4mol．2．Met(蛋氨酸)在酸解過程部分被破壞，所以量少。
氨基酸組份分析結(jié)果顯示與目的肽的組份相符，證明合成是成功的。
APP17肽用于治療神經(jīng)元退行性變的可能性由下述藥效學(xué)實驗結(jié)果來證明。1．實驗方法采用國際公認(rèn)的實驗方法，包括水迷宮試驗、超微結(jié)構(gòu)研究、免疫組化、免疫印跡法和神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)。2．材料APP17肽由發(fā)明人按上述方法合成。實驗動物包括小鼠、大鼠，小鼠為昆明種屬，體重32-37克，8周齡。大鼠為Wistar種屬，250克左右，16周齡。3．三種動物模型制備和防治每種動物模型分對照組、模型組和治療組。
表1動物模犁制各和給藥
4．實驗結(jié)果甲、體內(nèi)實驗A．糖尿病小鼠a．水迷宮試驗表2:C組、DM組及17P+DM組水迷官試驗游完全程結(jié)果比較
注與DM組比較，*P＜0.01表3出現(xiàn)錯誤次數(shù)比較
注與DM組比較，*P＜0.05與DM組比較，**P＜0.01應(yīng)用APP17肽，可使病鼠游完全程所需時間縮短，錯誤反應(yīng)次數(shù)減少，說明模型鼠的學(xué)習(xí)功能已恢復(fù)正常。b．超微結(jié)構(gòu)光鏡下C組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元核仁明顯，核膜清楚，胞漿淡染；DM組部分神經(jīng)元胞漿深染，胞體增大；17P+DM組神經(jīng)元與C組相似。電鏡觀察神經(jīng)組織超微結(jié)構(gòu)顯示C組小鼠神經(jīng)原正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，表面有多聚核糖體附著，線粒體正常，核膜清楚，核仁明顯，神經(jīng)元軸突內(nèi)微管排列整齊成束；DM組神經(jīng)元固縮，深染，核膜凹陷，核內(nèi)染色質(zhì)溶解，線粒體電子密度高、脊斷裂，核糖體解聚，神經(jīng)原軸突內(nèi)微管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的斷裂或溶解現(xiàn)象，部分微管變?yōu)闊o定型絮狀物，血管周圍星形細(xì)胞突起腫漲；給APP17肽的糖尿病小鼠神經(jīng)元接近正常，胞漿內(nèi)高爾基體豐富，線粒體輕度腫漲，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，表面有多聚核糖體附著，微管結(jié)構(gòu)基本保持完好，排列整齊成束，只偶見斷裂或溶解現(xiàn)象，星形細(xì)胞輕度腫漲。c．海馬神經(jīng)元免疫組織化學(xué)海馬神經(jīng)元與學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知關(guān)系密切，所以我們主要分析海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。糖尿病小鼠海馬神經(jīng)元免疫組織化學(xué)研究結(jié)果見表4。
表4各種抗體陽性神經(jīng)元數(shù)目比較
*與DM組相比P＜0.05表5各種抗體陽性神經(jīng)元灰度比較
*與DM組相比P＜0.05表4，表5可見1)微管相關(guān)蛋白tau過度磷酸化2)Aβ(β-淀粉樣肽)增加3)神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏4)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶減少這些結(jié)果表明神經(jīng)元代謝明顯障礙，而所有這些異常均可被APP17肽恢復(fù)正常。d．免疫印跡(Western Blot)結(jié)果DM組小鼠199/202位點異常酸磷化的tau蛋白增多，用APP17肽后恢復(fù)至接近正常水平(圖1)；糖尿病小鼠tubulin表達(dá)減少，用APP17肽后可使其表達(dá)增加(圖2)；糖尿病小鼠APP表達(dá)增多，用APP17肽后有所降低(圖1-3)。
e．坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和痛閾表6肌電誘發(fā)電位左側(cè)大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度
注與C組比較*P＜0.05與DM組比較#P＜0.05APP17肽可明顯改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度和縮短潛伏期。APP17肽持續(xù)應(yīng)用7周，可改善病鼠痛閾。
f．對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成份的影響。
腦神經(jīng)元的胰島素受體底物-1、胰島素樣生長因子-1受體Ⅰ型在糖尿病時增加，APP17肽應(yīng)用后恢復(fù)正常。
g．對血糖和血糖調(diào)節(jié)激素的影響靜脈大劑量注射APP17肽對血糖無影響。
表7三組大鼠血漿胰島素、胰升糖素和C肽的比較
注與C組比較*P＜0.05B．去卵巢大鼠模型a．水迷宮試驗表8游完水迷宮全程所需時間
*與OVX組比較P＜0.05
表9水迷宮測試錯誤反應(yīng)次數(shù)
**與OVX組比較P＜0.01表8、表9說明APP17肽使模型鼠學(xué)習(xí)、記憶功能恢復(fù)正常。b．超微結(jié)構(gòu)OVX組線粒體腫脹明顯，嵴斷裂、消失、溶解，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有部分脫顆粒，毛細(xì)血管周圍星形細(xì)胞足突腫脹明顯。神經(jīng)氈中突觸的軸突側(cè)有腫脹，內(nèi)有突觸小泡，樹突側(cè)變化不太明顯。微管排列比較整齊，變化不明顯，局部偶有斷裂，但軸內(nèi)線粒體存在明顯腫脹。17P+OVX組線粒體未見腫脹，毛細(xì)血管周圍星形細(xì)胞足突或正常或較OVX組明顯減輕。神經(jīng)氈也較OVX組好，突觸前終末小泡密集，軸突終末未見腫脹。微管排列整齊。c．海馬神經(jīng)元免疫組化表10三組大鼠海馬各種抗體陽性細(xì)胞數(shù)目比較
*與OVX組相比P＜0.05,**與OVX組相比P＜0.01表11三組大鼠海馬各種抗體陽性細(xì)胞平均灰度比較
*與OVX組相比P＜0.05,*與OVXg組相比P＜0.05。
**與OVX組相比P＜0.01,**與OVX組相比P＜0.01表10、表11可見去卵巢大鼠tau蛋白過度磷酸化，Aβ增加和神經(jīng)營養(yǎng)因子減少，但APP17肽可使之恢復(fù)正常。
d．對血雌激素濃度的影響表12三組大鼠血清雌激素水平比較
**與OVX組相比P＜0.05,**與OVX組相比P＜0.05。
表12說明APP17肽并不改變?nèi)ヂ殉泊笫笱宕萍に厮健?br> C．半乳糖老化小鼠a．水迷宮試驗表13水迷宮實驗結(jié)果(游完全程所需時間秒)
*與D組比較，p＜0.05**與D組比較p＜0.01.
表14水迷宮實驗結(jié)果(錯誤反應(yīng)次數(shù) 次)
*與D組比較p＜0.05；**與D組比較p＜0.01.
表13、表14說明APP17肽可使模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶恢復(fù)正常。b．超微結(jié)構(gòu)光鏡下D組和17p+D組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元核仁明顯，核膜清楚，胞漿淡染，無顯著區(qū)別；電鏡觀察兩組超微結(jié)構(gòu)顯示(2)D-gal組小鼠海馬神經(jīng)元軸索微管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯溶解；線粒體肥大增生腫脹并有空泡變性，電子密度增高；核糖體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯減少；神經(jīng)氈中突觸稀疏，線粒體肥大增生腫脹并有空泡變性，電子密度增高，單位面積內(nèi)線粒體數(shù)量多于APP17肽組，但差異不顯著；海馬神經(jīng)原的結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)異常變化。(2)17p+D組小鼠海馬神經(jīng)元軸索中微管結(jié)構(gòu)正常，微絲清晰；線粒體膜及結(jié)構(gòu)正常，線粒體脊清晰；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體豐富；神經(jīng)氈中單位面積內(nèi)突觸數(shù)量明顯多于半乳糖組P＜0.05，突觸內(nèi)可見大量清亮突觸小泡。
表15:17p+D組、D組海馬神經(jīng)氈中突觸數(shù)和線粒體數(shù)
*P＜0.05c．免疫組化表16:C組、D組及D+P組大腦海馬NT-3及膽堿乙酰化酶陽性細(xì)胞數(shù)及灰度比較
注陽性細(xì)胞數(shù)為每高倍鏡視野的細(xì)胞個數(shù)；與D組比較，*P＜0.05,**P＜0.01可見NT-3和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶在應(yīng)用APP17肽后表達(dá)恢復(fù)正常。乙、體外實驗應(yīng)用SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞株A．APP17肽對SY5Y細(xì)胞的營養(yǎng)作用(1)APP17肽促進(jìn)培養(yǎng)的SY5Y細(xì)胞軸突延伸，胞體面積增加。正常對照組軸突長度為42.22±22.07，加入APP17肽組軸突長度為89.09±38.11(p=0.00)。正常對照組胞體面積為749.69±207.65，加肽組為1056.71±326.68(p=0.000)。
(2)APP17肽促使SY5Y細(xì)胞NT-3、NF表達(dá)增加(圖4、5)，胰島素降解酶素(IDE)表達(dá)下降(圖6)。B．APP17肽對高糖引起神經(jīng)毒作用的影響(1)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示從接種第6天始，APP17肽組細(xì)胞數(shù)增加，1μM組與對照組相比，P＜0.05,10μM組與對照組相比，P＜0.01；接種后第9天，APP17肽組細(xì)胞數(shù)仍高于對照組，有高度顯著性差異。而高糖組細(xì)胞數(shù)從第3天始，明顯低于對照組，二者相比P＜0.01，且一直持續(xù)至第9天；高糖加APP17肽組與高糖組相比，細(xì)胞數(shù)無顯著性差異。
表17細(xì)胞計數(shù)觀察APP17肽對SY5Y生長的影響
*與對照組相比 P＜0.05,**與對照組相比P＜0.01表18細(xì)胞計數(shù)觀察高糖環(huán)境對SY5Y生長的影響平均細(xì)胞數(shù)±SD(n=8)
**與對照組相比P＜0.01(2)MTT代謝率測定結(jié)果顯示APP17肽組OD值明顯高于對照組，增加幅度為175％,P＜0.01。而高糖組OD明顯低于對照組，降低幅度為26.15％,P＜0.01，高糖加APP17肽組OD值明顯高于對照組，升高幅度為20.08％,P＜0.01。
(3)LDH漏出率測定結(jié)果顯示APP17肽組LDH為254.3±44.1u，與對照組(306.3±71.8u)相比無顯著性差異。高糖組LDH為1760.2±16.6u，明顯高于對照組(503.5±78.6u),P＜0.01，高糖加APP17肽組LDH為1560±25.8u，低于島糖組，P＜0.01C．APP17肽對谷氨酸引起神經(jīng)毒作用的影響(1)MTT代謝率測定結(jié)果顯示100uM、500uM、1mM谷氨酸組OD值明顯低于對照組，且隨著劑量增加，降低幅度分別為12.5％、21.8％和33.1％，與對照組相比P＜0.05，而50uM谷氨酸組OD值無明顯改變，與對照組相比P＞0.05。谷氨酸100uM、500uM加APP17肽10uM組OD值明顯高于谷氨酸組，升高幅度分別為14.0％、22.4％，兩組相比P＜0.05，加肽組與對照組相比P＞0.05。
(2)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示從接種后第4天起，谷氨酸500uM組細(xì)胞數(shù)低于對照組，P＜0.05。谷氨酸加APP17肽10uM組細(xì)胞數(shù)高于谷氨酸組，兩組相比P＜0.05，與對照組相比P＞0.05。
表19細(xì)胞計數(shù)觀察APP17肽對谷氨酸引起神經(jīng)毒作用的影響平均細(xì)胞數(shù)±SD(n=8)
與對照組相比P＜0.05,**與*相比P＜0.01(3)LDH漏出率測定結(jié)果顯示谷氨酸100uM、500uM組LDH漏出率明顯高于對照組，兩組相比P＜0.01。谷氨酸100uM、500uM加APP17肽組LDH漏出率低于谷氨酸組，但未完全恢復(fù)正常水平。
(4)免疫斑點結(jié)果顯示谷氨酸組NT-3、NF表達(dá)低于對照組，而加入APP17肽后可使表達(dá)恢復(fù)正常(圖7、8)。
附圖簡要說明附圖1:AT-8免疫印跡染色●AT-8(1∶200)●a:C組●b:DM組●c:DM+17肽組附圖2:tubulin抗體免疫印跡染色●tubulin抗體(1∶400)●a:C組●b:DM組●c:DM+17肽組附圖3:Aβ1-16抗體免疫跡染色●Aβ1-16抗體(1∶2)●a:C組●b:DM組●c:DM+17肽組附圖4:APP17肽對SY5Y細(xì)胞NT-3表達(dá)的影響1．空白對照組2．APP17肽10μmol/L處理組第1抗體抗NT-3抗體(1∶200稀釋)附圖5:APP17肽對SY5Y細(xì)胞NF表達(dá)的影響1．正常對照組2．APP17肽10μmol/L處理組第1抗體抗NT-3抗體(1∶200稀釋)附圖6:APP17肽對SY5Y細(xì)胞IDE表達(dá)的影響1．APP17肽10μmol/L處理組2．空白對照組第1抗體抗IDE抗體(1∶500稀釋)附圖7:APP17肽對谷氨酸引起SY5Y細(xì)胞毒作用的影響1．對照組2．谷氨酸500μM加APP17肽10μM組3．谷氨酸500μM組第1抗體抗NT-3抗體附圖8:APP17肽對谷氨酸引起細(xì)胞毒傷作用的影響1．對照組2．谷氨酸500μM加APP17肽10μM組
3．谷氨酸500μM組第1抗體抗NT-3抗體附圖9:APP17肽HPLC圖附圖10:APP17肽氨基酸組份分析結(jié)果D-285009/20/99 19:24SAMPLE: TAG: 102CH:1 VIAL: 2 PRO0-NO.:1HILE: 1 CALC-METHOD:EXT-STD TADLE: 1 CONC:AREANO. NAME RT HEIGHT AREAn mol ngRATIO2 5.82 156773346520.334 0.0 0.06 Ser8.22 388176505382.039214.3 94.67 Glu9.12 156591 27728649.854 1449.5 96.89 Ala12.90 83469 12969414.576407.7 98.010 Val14.08 434226160672.218260.0 99.511 Met15.44 408057750602.575384.2 99.613 Leu18.99 243466334402.216290.7 99.81520.38 2379 284310.028 0.0 0.01621.70233 109800.010 0.0 0.018 Lys23.32 100095 14052094.462652.3 100.519 NH324.64 42047 10005946.015102.2 100.620 His25.76 368126573142.193340.4 100.622 Arg30.25 66670 18190576.328 1102.3 99.3TOTAL656763 12001147 42.854 5204.1PEAK REJ: 10000SF : 1.000SAMP-AMT: 1.000INJ-VOL : 10.00國外研究證明APP17肽是具有神經(jīng)營養(yǎng)作用物多肽，我們的工作還證明了下述幾點1．APP17肽可能通過胰島素受體底物-1發(fā)揮功能，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的對話，可治療胰島素、雌激素缺乏以及氧化損傷引起的實驗性神經(jīng)元退行性變。
2．對神經(jīng)元具有保護(hù)作用。
3．皮下給藥具有治療效果。
4．沒有急性毒性反應(yīng)。
從上述體內(nèi)外實驗表明，APP17肽能明顯改善胰島素、雌激素嚴(yán)重缺乏和氧化損傷引起的神經(jīng)元退行性變。據(jù)我們研究，神經(jīng)元退行性變的發(fā)生機(jī)理如圖11。
因為神經(jīng)元存活和功能的維持需要各種神經(jīng)存活因子的支持，當(dāng)各種原因引起神經(jīng)存活因子減少和Aβ增加均可引起神經(jīng)元功能降低和神經(jīng)元退行性變。一種神經(jīng)存活因子減少可誘發(fā)多種神經(jīng)存活因子的減少，使突觸后神經(jīng)元受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)度低于使神經(jīng)元基因轉(zhuǎn)錄激活的強(qiáng)度，給予外源性APP17肽可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而激活神經(jīng)元功能，治療神經(jīng)元退變。
我們確信APP17肽將是針對治療神經(jīng)元退行性變疾病的有效藥物，根據(jù)我們現(xiàn)有的研究結(jié)果，可預(yù)期APP17肽的治療譜至少可包括1．輕、中度AD2．糖尿病神經(jīng)病變3．絕經(jīng)期綜合癥4．腦和外周神經(jīng)損傷5．帕金森氏綜合癥6．腦缺血引起的神經(jīng)元損傷APP17肽治療神經(jīng)元退行性變疾病的給藥方法可以是在肽中加入少量人血清白蛋白或甘露醇作輔型劑。常規(guī)給藥途徑為皮下注射，每周二次。對重癥病人如糖尿病外周神經(jīng)病變可靜滴每日一次，二周后改為皮下注射，三個月為一療程。也可經(jīng)微囊包裹口服。預(yù)期還可以經(jīng)皮導(dǎo)入。
國外有關(guān)APP17肽的參考文獻(xiàn)1．Jin L.N et al:Peptides containing the RERMS sequence of amyloid beta/A4 proteinprecursor bind cell surface and promote neurite extensionJ.Neurosci 14:5461 1994β/A4淀粉樣肽前體蛋白中含有RERMS序列的肽段結(jié)合至細(xì)胞表面，并促進(jìn)軸突延長神經(jīng)科學(xué)雜志2．Bowes MP,et al:Reduction of Neurological damage by a peptide segment of theamyloid beta/A4 protein precursor in a rabbit spinal cord ischemia modelExp Neurol 129:112 1994在兔骨髓損傷模型中，β/A4淀粉樣肽前體蛋白的肽段減輕神經(jīng)損傷 神經(jīng)科學(xué)進(jìn)展。3．Yamamoto K et al:The survival of rat cerebral cortical neurons in the presence oftrophic APP peptideJ.Neurobiol 22:585 1994在營養(yǎng)性APP肽段存在條件下，大鼠大腦皮層神經(jīng)元可存活神經(jīng)生物學(xué)雜志4．Roch JM et al:Increase of synaptic density and memory retention by a peptiderepresenting the trophic domain of amyloid beta/A4 peptide precursorProc Natl Acad Sci USA 91:7450 1994β/A4淀粉樣肽前體蛋白中表現(xiàn)出營養(yǎng)作用的肽段部位可增加突觸密度和記憶保留功能 美國自然科學(xué)進(jìn)展5．Milward EA et al:The amyloid protein precursor of Alzheimer′s disease is a mediatorof the effects of nerve growth factor on neurite outgrowthNeuron 9:129 1992老年性癡呆的淀粉樣蛋白前體是作用于軸突延伸的神經(jīng)營養(yǎng)因子的調(diào)節(jié)物 神經(jīng)元雜志6．Ninomiya H et al:Amino Acrd sequence RERMS represents the active dimain ofamyloid β/A4 protein precursor that promotes fibroblast growthJ.Cell Biol 121:879 1993β/A4淀粉樣肽前體蛋白中RERMS氨基酸序列表現(xiàn)出促進(jìn)纖維母細(xì)胞生長的活性細(xì)胞生物學(xué)雜志7．Saitoh T et al:Induction of signal-transducting pathways by APP Binding to the CellSurface Receptorin″Research Advances in Alzheimer′s Disease and related disorders″ed.by K.Iqbal etal c 1995 John wiley & Sons Ltd通過APP結(jié)合至細(xì)胞表面受體，發(fā)現(xiàn)信號傳導(dǎo)途徑 老年性癡呆及其相關(guān)疾病研究進(jìn)展國內(nèi)有關(guān)APP17肽的參考文獻(xiàn)1．糖尿病小鼠腦組織超磷酸化及其機(jī)理研究趙詠梅 姬志娟 趙志煒 錢玉英 晉志高 裴進(jìn)京 盛樹力中華內(nèi)分泌代謝雜志15(1):38 19992．β淀粉樣肽前體蛋白和β淀粉樣肽研究進(jìn)展盛樹力老年醫(yī)學(xué)與保健5(1):4 19993．糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙與腦形態(tài)學(xué)改變關(guān)系的研究馬學(xué)毅 盛樹力 胡景勝 趙詠梅 趙志煒 錢玉英中國糖尿病雜志7(3):150 19994．糖尿病大鼠腦組織鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶研究吳燕川 艾厚喜 盛樹力 高清山 石太平 魏群中國糖尿病雜志7(4):222 19995．APP17肽對糖尿病小鼠微管結(jié)構(gòu)和tau蛋白磷酸化有關(guān)酶類的影響趙詠梅 趙志煒 姬志娟 錢玉英 孫異臨 晉志高 盛樹力中華老年醫(yī)學(xué)雜志18(5):306 19996．APP17肽對糖尿病小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能及海馬NT-3、膽堿乙酰化酶神經(jīng)元表達(dá)的影響錢玉英 趙詠梅 姬志娟 趙志煒 盛樹力中華老年醫(yī)學(xué)雜志18(6):19997．孟艷等APP17肽對β-淀粉樣肽及有關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響8．張人玲等APP17肽對糖尿病大鼠外周神經(jīng)損傷的防治作用中華內(nèi)分泌代謝雜志(已修回)9．王蓉等APP17肽對高糖環(huán)境引起神經(jīng)毒作用的影響中國糖尿病雜志(已修回)10．王蓉等APP17肽對谷氨酸引起神經(jīng)毒作用的影響(已修回)11．王蓉等APPN端多肽片段的神經(jīng)營養(yǎng)作用(已修回)12．王冬娜等APP17肽對去卵巢大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能及海馬神經(jīng)元NT-3、NF表達(dá)的影響(已修回)13．王晶等APP17肽對D-半乳糖腦老化模型小鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的影響中國藥理學(xué)通報(已修回)14．趙詠梅等實驗性糖尿病腦病海馬神經(jīng)原的β淀粉樣肽及結(jié)合蛋白的表達(dá)及APP17肽的作用中華內(nèi)分泌代謝雜志15．晉志高等APP17肽對糖尿病小鼠前腦內(nèi)NT-3表達(dá)的調(diào)節(jié)16．王昕等APP17肽對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中鈉鉀-ATP酶的影響17．王昕等APP17肽對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中cAMP、cGMP的影響18．王逢文等APP17肽對Tau蛋白超磷酸化表達(dá)的影響19．楊芳等APP17肽對去卵巢大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能及海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變和一些蛋白質(zhì)表達(dá)的影響20．王晶等APP17肽對D-半乳糖腦老化模型小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能及海馬神經(jīng)NT-3、NGF表達(dá)的影響 中華病理生理雜志21．盛樹力等老年性癡呆-最難治的疾病22．盛樹力等APP17肽對實驗性腦病的防治作用23．趙志煒等APP17肽對糖尿病小鼠腦Tau蛋白的影響研究方法的主要參考文獻(xiàn)1．Fuller SJ,Storey E,et al.Intracellular production of βA4 Amyloid of Alzheimer’sDisease:Modulation by phosphoralytion and lack of coupling to the secretion of theAmyloid precursor protein.1995,34,8091-8098,Biochemistry細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生老年性癡呆的βA4淀粉樣肽通過磷酸化調(diào)節(jié)和缺乏淀粉樣肽前體蛋白分泌的偶合生物化學(xué)雜志2．Ostrerova N,Petrucelli L,et al.α-Synuclein shares physical and functionalhomology with 14-3-3 proteins.The Journal of Neurosci.1999,19(14):5782-5791α-共核蛋白與14-3-3蛋白在生理功能上有同源性神經(jīng)科學(xué)雜志3．Faircloth GT, Stewart D,Clement JJ.A simple screening procedure for thequantitative measurement of cytotoxicity to resting primary lymphocyte cultures.Journal of Tissue Culture Methods.1988,11(4):201-205原代淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞毒性定量，測定的單純篩查步驟組織培養(yǎng)法雜志4．趙詠梅，趙志煒，姬志娟等。APP17肽對糖尿病小鼠微管結(jié)構(gòu)和tau蛋白磷酸化有關(guān)酶類的影響 中華老年醫(yī)學(xué)雜志18(5):306 1999錢玉英 趙詠梅等。APP17肽對糖尿病小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能及海馬NT-3、膽堿乙酰化酶神經(jīng)元表達(dá)的影響 中華老年醫(yī)學(xué)雜志18(6):1999
權(quán)利要求
1．氨基酸序列為丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-精氨酸-亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-賴氨酸-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-精氨酸-蛋氨酸-絲氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蛋氨酸(AKERLEAKHRERMSQVM)的十七肽在制備治療神經(jīng)元退行性變疾病的藥物中的應(yīng)用。
2．一種治療神經(jīng)元退行性變的藥物組合物，其特征在于它含有有效量的序列為丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-精氨酸-亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-賴氨酸-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-精氨酸-蛋氨酸-絲氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-蛋氨酸(AKERLEAKHRERMSQVM)的十七肽及可接受的輔劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種其序列為丙氨酸－賴氨酸－谷氨酸－精氨酸－亮氨酸－谷氨酸－丙氨酸－賴氨酸－組氨酸－精氨酸－谷氨酸－精氨酸－蛋氨酸－絲氨酸－谷氨酰胺－纈氨酸－蛋氨酸(AKERLEAKHRERMSQVM)的十七肽的新用途，它具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，本發(fā)明提示了它的治療神經(jīng)元退行性變疾病的新醫(yī)藥用途。
文檔編號A61K38/10GK1317341SQ00105798
公開日2001年10月17日 申請日期2000年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月11日
發(fā)明者盛樹力, 姬志娟, 趙詠梅, 王蓉, 趙志煒, 張景艷, 艾厚喜, 孟艷 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院