專利名稱：具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核苷酸及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，具體地說，涉及一種具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核 苷酸及其應用。
背景技術：
上世紀八十年代日本學者發現卡介苗(BCG)中的DNA組分在人和動物體內具有抗 腫瘤活性，后來研究反義核酸治療的科學家又發現人工合成的硫代寡聚脫氧核苷酸存在非 特異的免疫刺激活性。Krieg AM等在《Nature》1995，第374卷、第546-549頁中揭示了這 些現象的本質，發現核酸中的免疫刺激活性成分是一些含有非甲基化5' -CpG-3' 二核苷 酸的六核苷酸序列，特征為5’ -PuPuCpGPyPy-3’ (Pu代表嘌呤A或G ;Py代表嘧啶C或T)， 如5’ -GACGTT-3’等。其中，核心核苷酸C和G為其活性所必需，兩端各兩個核苷酸也與其 活性緊密相關。上述六核苷酸特征序列稱作CpG基元(CpG motif)，含有CpG基元的寡聚脫 氧核苷酸統稱為CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)。含有上述特征的CpG-ODN對小鼠具有良 好的免疫刺激活性，動物實驗結果顯示了 CpG-ODN在疫苗佐劑、腫瘤預防和治療、感染預防 和治療以及過敏預防和治療等領域具有良好的應用前景。但是進一步研究發現其免疫刺激 活性具有種屬特異性，因此闡明活化人免疫細胞的CpG基元和CpG-ODN是將CpG-ODN應用 于人體臨床的必要前提。Krieg AM等在《The Journal of Immunology 2000，第164卷、第 1617-1624頁中報道了第一個能夠活化人免疫細胞的CpG基元5’_GTCGTT_3’。由此衍生的 CpG-ODN(如CpG-ODN 2006)在體外對人免疫細胞具有良好的免疫刺激活性，而且目前多個 人體臨床研究也證實了 CpG-ODN 2006在疫苗佐劑、腫瘤治療以及感染治療等領域的免疫 效果。根據Krieg AM等研究結果，上述CpG-ODN是人特異的，對小鼠沒有活性，因此只能用 猴子等靈長類動物作為動物模型來評價這些序列在體內的免疫刺激活性，這增加了實驗的 難度，例如成本增加、動物來源難于獲得等。因此，發現一種非種屬特異性的廣譜CpG-ODN 是十分有必要的。對于有關CpG-ODN的研究在文獻《中華微生物學和免疫學雜志》2001,21 (5)，第 471-475頁、《動物醫學進展》2004，25 (4)，第25-28頁、《Gene Therapy)) 1996，第6卷，第 893-903 頁中有所描述。另外，專利文獻 CN 1271733A、CN 1526718A、US 2005/0267057A1 或TO 99/56755中也公開了一些CpG-ODN及其相關的應用，但是在上述文獻中，均未公開有 關具有兩個或兩個以上拷貝的5’-NTCGTT-3’基元(N不代表A或G)的核苷酸，也未公開任 何有關包含該基元的硫代寡聚脫氧核苷酸對人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的技術啟示。

發明內容
本發明的目的在于提供一種非種屬特異性的、具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核苷酸。更具體地說，本發明提供了一種對人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的硫代寡聚脫 氧核苷酸。本發明的目的還在于提供該具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核苷酸在制備疫 苗佐劑以及在制備預防或治療腫瘤、感染和過敏的藥物中的應用。本發明人在現有技術的基礎上進行研究，發現(1)活化人免疫細胞的CpG基元 為5’-NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或Τ) ； (2)活化小鼠免疫細胞 的CpG基元為5’ -NA/TCGTT-3’ (其中N代表A、G、C或Τ)。在此研究基礎上，發現出含有 5，-NTCGTT-3，基元(包括 5，-ATCGTT-3，、5，-GTCGTT-3，、5，-CTCGTT-3，和 5，-TTCGTT-3，) 的CpG-ODN對人和小鼠具有交叉免疫刺激活性。發明人進一步研究表明，核苷酸序列中具 有兩個或兩個以上拷貝的5’ -NTCGTT-3’基元(N不代表A或G)是本發明所述的硫代寡聚 脫氧核苷酸對人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的關鍵。鑒于此，本發明提供了一種具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核苷酸，其序列中 具有兩個或兩個以上拷貝的5’-NTCGTT-3’基元，所述N不代表A或G，優選為T或C。所述 硫代寡聚脫氧核苷酸的長度為15 35個核苷酸，優選為20 30個核苷酸。所述CpG是 非甲基化的。當N為T時，所述硫代寡聚脫氧核苷酸的序列優選為5 ’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、5' -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、5 ’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、5，-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3，、5 ’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、5 ’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、5，-TTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3，、5，-TTCGTTATTCGTTATTCGTT-3，、5，-TTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3，、5，-TTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3，、
5，-TCTTCGTTATTCGTTATTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’、5， -TCTTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’、5’ -TTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3，、5， -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3，、5 ’ -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、5， -TTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，、5' -TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3‘或
5，-TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，。 當所述N為C時，所述硫代寡聚脫氧核苷酸的序列優選為
4
5， -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3，或5’ -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3，。本發明所述的硫代寡聚脫氧核苷酸的制備方法是本領域技術人員所熟知的，例如 可以采用固相亞磷酰胺三酯法化學合成，此法具有高效和快速偶聯等優點，已廣泛應用于 DNA化學合成領域中。目前對于寡聚脫氧核苷酸人工合成多委托專業的基因合成公司來處 理，例如國內可委托上海生工生物技術公司合成。固相亞磷酰胺三酯法由3’端開始，具體反應步驟如下1.脫保護基用三氯乙酸脫去連接在CPG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸 的保護基團DMT(二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5’羥基，以供下一步縮合反應使用；2.活化將亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進入合成柱，形成 亞磷酰胺四唑活性中間體(其3’端已被活化，但5’端仍受DMT保護)，此中間體與CPG上 已脫保護基的核苷酸發生縮合反應；3.連接亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CPG上已脫保護基的核苷酸時，將與其5’ 羥基發生親合反應，縮合并脫去四唑，此時寡核苷酸鏈向前延長一個堿基；4.氧化縮合反應時核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CPG上的寡核苷酸連接， 而亞磷酯鍵不穩定，易被酸或堿水解，此時使用硫代試劑將亞磷酰胺氧化為硫磷雙鍵的磷 酸三酯，從而得到穩定的寡核苷酸；5.封閉縮合反應后為了防止連在CPG上的未參與反應的5’羥基在隨后的循環 反應中被延伸，常通過乙酰化來封閉此端羥基。經過以上五個步驟后，一個脫氧核苷酸就被連到CPG的核苷酸上。重復以上的脫 保護基、活化、連接、氧化、封閉過程即可得到一個DNA片段粗品。最后對其進行切割、脫保 護基、純化(常用的有PAGE法、HPLC法、C18法和OPC法等方法)、定量等合成后處理即可 得到符合本發明要求的硫代寡聚脫氧核苷酸。本發明還提供了硫代寡聚脫氧核苷酸在制備疫苗佐劑中的應用。本發明還提供了硫代寡聚脫氧核苷酸在制備預防或治療腫瘤的藥物中的應用。本發明還提供了硫代寡聚脫氧核苷酸在制備預防或治療感染的藥物中的應用。本發明還提供了硫代寡聚脫氧核苷酸在制備預防或治療過敏的藥物中的應用。所述硫代寡聚脫氧核苷酸在體外對人和小鼠免疫細胞均有良好的免疫刺激活性， 可以從對小鼠中的免疫刺激活性結果來評價其在人體中的免疫刺激活性。作為疫苗佐劑， 其能夠顯著增強小鼠對基因工程乙肝疫苗的免疫應答，而且能夠使免疫應答偏向TH1方向。 由于本發明所述的硫代寡聚脫氧核苷酸能夠誘生出很強的TH1類免疫應答，表明其也可用 于過敏和感染的預防和治療。同時，本發明所述的硫代寡聚脫氧核苷酸在小鼠體內也具有 良好的抑制腫瘤生長的活性。


圖1為示出具有5’-NTCGTPy_3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或Τ)基 元的寡聚脫氧核苷酸的人免疫刺激活性的圖。圖2為示出具有5’-NA/TCGTT_3’(其中N代表A、G、C或Τ)基元的寡聚脫氧核苷 酸的小鼠免疫刺激活性的圖。
圖3a為示出本發明寡聚脫氧核苷酸(Tl T6、C1和C2)以及對照序列1826的人 免疫刺激活性的圖。圖3b為示出本發明寡聚脫氧核苷酸(T7 T14)的人免疫刺激活性的圖。圖3c為示出本發明寡聚脫氧核苷酸(T15 T22)的人免疫刺激活性的圖。圖4a為示出本發明寡聚脫氧核苷酸(Tl T6、Cl和C2)以及對照序列1826和 T7C的小鼠免疫刺激活性的圖。圖4b為示出本發明寡聚脫氧核苷酸(T7 T14)的小鼠免疫刺激活性的圖。圖4c為示出本發明寡聚脫氧核苷酸(T15 T22)的小鼠免疫刺激活性的圖。圖5為示出本發明寡聚脫氧核苷酸作為疫苗佐劑增強小鼠對基因工程乙肝表面 抗原的免疫應答的圖。圖6為示出本發明寡聚脫氧核苷酸與其它疫苗佐劑聯用增強小鼠對基因工程乙 肝表面抗原的免疫應答的圖。圖7為示出本發明寡聚脫氧核苷酸在小鼠體內誘生TH1類免疫應答的圖。圖8為示出本發明寡聚脫氧核苷酸在小鼠體內抑制腫瘤生長的圖。
具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方式
的描述對本發明作進一步說明，但這并非是對本 發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要 不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。實施例1.具有5’ -NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或Τ)基 元的寡聚脫氧核苷酸的人免疫刺激活性為了闡明活化人免疫細胞的CpG基元，本發明人對CpG基元中除核心核苷酸CpG 以外的其余四個核苷酸進行了突變研究。為此，發明人設計了一組CpG-ODN，如表1所示，每 條序列長度為12個核苷酸，均含有兩個相同拷貝的CpG基元。用這些CpG-ODN刺激體外培 養的人外周血單個核細胞(PBMC)，通過測定培養上清中的IgM含量，即可評價它們對人免 疫細胞的活性。本實施例中所使用的CpG-ODN由本發明人設計，委托上海生工生物技術公司進行 人工合成，并進行全鏈硫代修飾，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化，溶于生理鹽水，-200C 冰箱中保存備用。表 權利要求
一種具有免疫刺激活性的全鏈硫代修飾的寡聚脫氧核苷酸，其序列中具有兩個或兩個以上拷貝的5’ NTCGTT 3’基元，且其長度為15～35個核苷酸，其中所述CpG是非甲基化的，并且所述N為C。
2.如權利要求1所述的全鏈硫代修飾的寡聚脫氧核苷酸，其特征在于所述全鏈硫代修 飾的寡聚脫氧核苷酸的長度為20 30個核苷酸。
3.如權利要求1或2所述的全鏈硫代修飾的寡聚脫氧核苷酸，其特征在于所述全鏈硫 代修飾的寡聚脫氧核苷酸的序列為5，-TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ 或5，-TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3'。
4.一種藥物組合物，其特征在于由權利要求1 3任意一項所述的全鏈硫代修飾的寡 聚脫氧核苷酸和藥學上可接受的載體制成。
5.權利要求1 3任意一項所述的全鏈硫代修飾的寡聚脫氧核苷酸在制備疫苗佐劑中 的應用。
6.權利要求1 3任意一項所述的全鏈硫代修飾的寡聚脫氧核苷酸在制備預防或治療 腫瘤、感染、過敏的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核苷酸，其序列中具有兩個或兩個以上拷貝的5’-NTCGTT-3’基元，且其長度為15～35個核苷酸，其中所述CpG是非甲基化的，并且所述N不代表A或G。該硫代寡聚脫氧核苷酸在體外對人和小鼠免疫細胞均有良好的免疫刺激活性，可以從對小鼠中的免疫刺激活性結果來評價其在人體中的免疫刺激活性。作為疫苗佐劑，其能夠顯著增強小鼠對基因工程乙肝疫苗的免疫應答，而且能夠使免疫應答偏向TH1方向，表明可用于過敏和感染的預防和治療。同時，本發明所述的硫代寡聚脫氧核苷酸在小鼠體內也具有良好的抑制腫瘤生長的活性。
文檔編號A61K31/7125GK101979566SQ20101052700
公開日2011年2月23日 申請日期2008年1月23日 優先權日2008年1月23日
發明者許洪林 申請人:許洪林