專利名稱：地錦草提取物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種脂肪酸合成酶抑制劑及其應用。
背景技術：
脂肪酸合酶原稱脂肪酸合成酶，(EC 2. 3. 1. 85, fatty acid synthase，縮寫為 FAS)，動物體內的脂肪酸合酶稱為I型FAS，原核生物及植物中的脂肪酸合酶稱為II型 FAS。國內外基礎研究表明，脂肪酸合酶是可以用于治療目的的潛在靶位。美國霍普金斯大學Loftus等對小鼠脂肪酸合成酶的研究結果證明，抑制脂肪酸 合成酶可造成丙二酰輔酶A的積累，而后者抑制與進食相關的下丘腦神經肽Y的表達，在不 影響小鼠活動能力的情況下使食欲下降，體重降低。T. Loftus等指出，脂肪酸合成酶可以作 為控制體重潛在的治療靶位(Loftus. Τ. M. et al. ,2000. Science, 288 (5475) :2379-2381)。 以上結果表明，抑制脂肪酸合成酶的活性，可抑制體內脂肪的合成，而且還能抑制動物的食 欲，限制攝入的脂肪量并消耗體內脂肪。因此，研制和開發脂肪酸合成酶的抑制劑具有重大 的減肥降脂肪的潛力。目前為止，已報道的脂肪酸合酶抑制劑較少，只有合成的C75 (Kuhajda F. P.， PizerE. S.，Li J. N.，et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，97，3450-3454 (2000))，較早發現 ^^^/^^ ^ (cerulenin) (Vance D. ,Goldberg I. ,Mitsuhashi 0. et al. Biochem BiophysRes Commun. 48，649-656 (1972))和綠茶中的酯型兒茶素 EGCG (Wang X.，Tian W. X. Biochem. Biophys. Res. Commun, 288 (5) :1200-1206 (2001))和 ECG(Wang X·，SongK. S. , Guo Q. X.，et al. Biochem Pharmacol, 66 :2039-2047 (2003)) 這些抑制劑所具有的共 同缺點是抑制活性不夠高，應用價值受到局限，因此尋找到抑制活性高的脂肪酸合酶抑制 劑具有重要的實際應用價值。本發明描述了地錦草提取物對FAS的抑制作用。地錦草(Euphorbia humifusa Wild.)，異稱地錦、奶花草、奶草、鋪地紅、蜈蚣草、 紅絲草、地馬桑、紅沙草、涼帽草、仙桃草、花被單、地瓣草等，為大戟科植物地錦Euphorbia hum ifusa Wi Ild或斑地錦Euphorbia maculata的干燥全草，一年生草本，含白色乳汁，生 于田野、路旁，我國各地均有分布。

發明內容
本發明的目的是提供一種脂肪酸合成酶抑制劑及其制備方法。本發明所提供的脂肪酸合酶抑制劑，是以地錦草為原料，用丙酮-水、乙醇-水浸 取得到；或用丙酮-酸水或乙醇-酸水混合溶劑經回流處理提取得到的。其中所述丙酮-水混合溶劑中丙酮的體積百分數可為50-70% ；所述乙醇-水 混合溶劑中乙醇的體積百分數可為50-70% ；所述混合溶劑與地錦草的重量份數比可為 8-30 1 ；所述酸水為無機酸，所述酸的濃度為lmol/L。所述浸取的方法可為在25_70°C下攪拌，或80_100°C下加熱回流；所述在25_70°C 下攪拌浸取的時間可為3- 小時；所述80-100°C下加熱回流的時間可為2-12小時。
為了提高所述提取物的純度，所述浸取后還進行過濾和濃縮；所述濃縮的方法為 除去濾液中的丙酮或乙醇，然后用乙酸乙酯從水相中萃取，收集乙酸乙酯提取液，再除去所 述乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，得到地錦草提取物。本發明的另一個目的是提供所述脂肪酸合成酶抑制劑的用途。本發明的所提供的脂肪酸合成酶抑制劑的用途是脂肪酸合成酶抑制劑在制備減 肥藥中的應用，以及在制備預防和/或治療癌癥藥物中的應用。本發明的所提供的脂肪酸合成酶抑制劑還可以作為食品添加劑、日用化學品添加 劑及保健品添加劑等得到廣泛應用。以本發明所提供的脂肪酸合成酶抑制劑為活性成分制備減肥藥物以及預防和/ 或治療癌癥的藥物也屬于本發明的保護范圍。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載 體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面 活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑、和著色劑等。用地錦草提取物制備的減肥藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服 液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。本發明的脂肪酸合酶抑制劑將在以脂肪酸合酶為靶點的相關疾病的預防及輔助 治療方面，在制備控制體重、防治與肥胖相關的疾病等方面的藥物，特別是在制備防治癌癥 等方面的藥物中發揮巨大作用。同時，本發明的脂肪酸合酶抑制劑在保健品及化妝品德生 產中也會有較大的應用價值。


圖1為地錦草最佳溶劑的選擇圖；圖1中圖IA是地錦草對脂肪酸合酶的抑制率比較 (乙醇體系)、圖IB為不同比例丙酮提取地錦草對FAS的抑制率；
圖2為地錦草提取物IC5tl的測定曲線圖；圖2A是70%丙酮提取地錦草IC5tl的測定； 圖2B為地錦草乙醇萃取物IC5tl的測定。
具體實施例方式下述實施例中，所用的脂肪酸合酶均為用常規方法(W.X. Tian et al. , 1985. J. Biol. Chem. ,260(20) :11375-11387 ；田維熙等，1996.不同生長期蛋雞的體脂水平和肝 臟脂肪酸合成酶活性的關系.生物化學雜志，12(2) =234-236)自新鮮鴨肝中分離提純的， 并經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為單一帶。脂肪酸合酶活性采用乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A、NADPH為底物的標準測活方法 測定(W. X. Tian et al.，1985. J. Biol. Chem. , 260 (20) :11375-11387 ；田維熙等，1996.不同生 長期蛋雞的體脂水平和肝臟脂肪酸合成酶活性的關系.生物化學雜志，12 (2) =234-236) 0實施例1、脂肪酸合酶抑制劑地錦草有效物質的制備
將地錦草粉碎，用下述方法提取有效物。 用乙醇-水混合溶劑(乙醇的體積百分數為50% )與上述粉碎的地錦草按重量份 數比8 1混合，室溫25°C下攪拌浸取12小時，用普通濾紙過濾；在同樣條件下再浸取12 小時，然后用普通濾紙過濾，將兩次濾液合并。在0.09MPa，4(TC (減壓)低溫蒸發除去乙醇，得到含有效物質的水相，用等體積的石油醚脫去其中的脂類物質，再用等體積乙酸乙酯 萃取3次，合并乙酸乙酯層，如上減壓低溫蒸發除去有機溶劑，得到浸膏，將該浸膏(真空) 干燥(50°C)得到固態的地錦草提取物，將該固態地錦草提取物稱為地錦草提取物A。實施例2、脂肪酸合酶抑制劑地錦草有效物質的制備將地錦草粉碎，用下述方法提取有效物。用丙酮-水混合溶劑(丙酮的體積百分數為70% )與上述粉碎的地錦草按重量 份數比為15 1混合，80°C加熱回流3小時，進行普通濾紙的過濾；在同樣條件下再加熱回 流2小時，進行普通濾紙的過濾，將兩次濾液合并。在0.09MPa，35°C (減壓)低溫蒸發濃 縮，除去其中的有機溶劑，得到有效物質水相，對水相中的有效物進一步濃縮，具體方法為 先用等體積的石油醚分3-4次進行萃取，除去其中的脂類物質，再用乙酸乙酯進行萃取，將 乙酸乙酯提取液在0.09MPa，40°C (減壓)低溫蒸發濃縮，除去有機溶劑得到經濃縮的有效 物浸膏，即地錦草提取物。將此浸膏進一步在40-50°C (真空)干燥得到固態的地錦草提取 物，將該固態地錦草提取物稱為地錦草提取物B。實施例3、脂肪酸合酶抑制劑地錦草有效物質的制備將地錦草粉碎，用下述方法提取有效物。用乙醇-水混合溶劑(乙醇與水的體積份數比為70 30)與上述粉碎的地錦草按 重量份數比為20 1混合，100°C加熱回流3小時，然后進行普通濾紙的過濾，在同樣條件下 再加熱回流2小時，然后進行普通濾紙的過濾，將兩次濾液合并。在0.09MPa，4(TC (減壓)低 溫蒸發濃縮，除去其中的有機溶劑，得到含有效物質的水相，即地錦草提取物。對水相中的有 效物進一步濃縮，具體方法為用乙酸乙酯進行萃取，將乙酸乙酯提取液在0.09MPa，4(TC (減 壓)低溫蒸發濃縮，除去有機溶劑得到經濃縮的有效物浸膏，將此浸膏在40°C進一步(真空) 干燥得到固態的地錦草提取物，將該固態地錦草提取物稱為地錦草提取物C。實施例4、脂肪酸合酶抑制劑地錦草有效物質的制備將地錦草粉碎，用下述方法提取有效物。用丙酮-酸水混合溶劑(丙酮的體積百分數為70%，酸的濃度為lmol/L)與上 述粉碎的地錦草按重量份數比為15 1混合，100°C加熱回流3小時，進行普通濾紙的過 濾；在同樣條件下再加熱回流2小時，進行普通濾紙的過濾，將兩次濾液合并。在0. 09MPa, 35°C (減壓)低溫蒸發濃縮，除去其中的有機溶劑，得到有效物質水相，對水相中的有效物 進一步濃縮，具體方法為先用等體積的石油醚分3-4次進行萃取，除去其中的脂類物質， 再用乙酸乙酯進行萃取，將乙酸乙酯提取液在0.09MPa，40°C (減壓)低溫蒸發濃縮，除去 有機溶劑得到經濃縮的有效物浸膏，即地錦草提取物。將此浸膏進一步在40-50°C (真空) 干燥得到固態的地錦草提取物，將該固態地錦草提取物稱為地錦草提取物D。實施例5、脂肪酸合酶抑制劑地錦草有效物質的制備將地錦草粉碎，用下述方法提取有效物。用乙醇-酸水混合溶劑(乙醇與水的體積份數比為70 30，酸的濃度為lmol/L) 與上述粉碎的地錦草按重量份數比為20 1混合，100°C加熱回流3小時，然后進行普通濾 紙的過濾，在同樣條件下再加熱回流2小時，然后進行普通濾紙的過濾，將兩次濾液合并。 在0.09MPa，40°C (減壓)低溫蒸發濃縮，除去其中的有機溶劑，得到含有效物質的水相，即 地錦草提取物。對水相中的有效物進一步濃縮，具體方法為用乙酸乙酯進行萃取，將乙酸乙酯提取液在0.09MPa，40°C (減壓)低溫蒸發濃縮，除去有機溶劑得到經濃縮的有效物浸 膏，將此浸膏在40°C進一步(真空)干燥得到固態的地錦草提取物，將該固態地錦草提取物 稱為地錦草提取物E。實施例6、對脂肪酸合酶抑制活性的檢測37°C下，在2毫升石英比色皿中加入該酶底物0. 2mM乙酰輔酶A溶液25微升， 0. 4mM,丙二酸單酰輔酶A溶液50微升和1. 3mM NADPH溶液50微升，再加入0. 1M，pH 7. 0 磷酸鹽緩沖液1. 85毫升及FAS溶液30微升混勻，啟動酶促反應。用分光光度計監測單位 時間內340nm波長處吸光值A的變化，以(ΔΑ/min)來表示FAS的活力。地錦草藥材粉碎， 過40目篩，加入溶劑(1 20)，室溫攪拌4小時后，離心分離上清液，稀釋十倍后測定提取 液對FAS的抑制率。在一定濃度地錦草提取物存在下，FAS全酶反應的活力下降，當其活力 下降一半時所需槭葉提取物的濃度即IC5tl值，用該數值表示地錦草提取物對FAS的抑制能 力，上述測活體系中FAS的終濃度為7微克/毫升。測定結果表明在上述測活條件下，地錦草70%丙酮溶液提取液對FAS的抑制率 最高，達到59. 01%，測活體系中原藥濃度為37. 5(yg/ml)(見圖1A-B)。地錦草提取物的 IC50分別為11-23微克/毫升(見圖2A-B)。實施例7、腫瘤細胞實驗細胞培養將肝癌BEL-7402、乳腺癌MCF-7、前列腺癌PC-3M、宮頸癌Hela、食道 癌CAES-17五種癌細胞株(均購自醫科院藥物研究所)培養于含10%小牛血清、青霉素 (100yg/ml)和鏈霉素(100yg/ml)的RPMI-1640培養液中，在適當濕度，含5% CO2的培 養箱中37°C單層貼壁傳代培養。收集對數生長期的五種腫瘤細胞，分別接種于96孔板中，2 X IO4個/孔，貼壁培養 24小時換成分別含有按照實施例1、實施例2和實施例3方法獲得的地錦草提取物的培養 液，按不同地錦草提取物濃度分成7組(設0、5、10、20、40、60、80 μ g/ml共7個實驗組，每 個濃度設3個復孔，實驗結果取平均值)。繼續培養M小時，換成不含提取物的培養液，同時加入20 μ 1 MTT (四甲基偶氮唑 藍，5mg/ml)繼續培養4小時。棄上清液，每孔加入200 μ 1 二甲基亞砜(DMSO)(對照組加 入等量培養液和二甲基亞砜)，水平震蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。用酶標儀測定吸光 值(A)，波長570nm，并按下述公式計算提取物對癌細胞生長的抑制作用，結果如表1、表2、 表3、表4、表5所示，細胞生長抑制率(％ ) = (1-實驗組A57tl/對照組A57tl) X 100%表1不同濃度地錦草槭提取物(作用M小時)對腫瘤細胞生長的抑制率(％ )
權利要求
1.地錦草提取物在制備脂肪酸合成酶抑制劑中的應用，所述脂肪酸合成酶抑制劑是以 地錦草為原料，用丙酮-水、乙醇-水浸取得到；或用丙酮-酸水或乙醇-酸水混合溶劑經 回流處理提取得到的；其中所述丙酮-水混合溶劑中丙酮的體積百分數可為50-70% ；所述乙醇-水混合溶 劑中乙醇的體積百分數可為50-70%;所述混合溶劑與地錦草的重量份數比可為8-30 1 ； 所述酸水為無機酸，所述酸的濃度為lmol/L。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述浸取的方法可為在25-70°C下攪拌， 或80-100°C下加熱回流；所述在25-70°C下攪拌浸取的時間可為3- 小時；所述80-100°C 下加熱回流的時間可為2-12小時。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述濃縮的方法為除去濾液中的丙酮或 乙醇，然后用乙酸乙酯從水相中萃取，收集乙酸乙酯提取液，再除去所述乙酸乙酯提取液中 的乙酸乙酯，得到地錦草提取物。
4.權利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制劑在制備減肥藥中的應用。
5.權利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制劑在作為食品添加劑中的應用。
6.權利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制劑在作為保健品添加劑中的應用。
7.權利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制劑在日用化學品添加劑中的應用。
8.一種預防和/或治療癌癥的藥物，其活性成分為權利要求1所述的脂肪酸合成酶抑 制劑。
9.一種減肥藥，其活性成分為權利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制劑。
全文摘要
本發明是一種地錦草提取物的應用。本發明公開了一種脂肪酸合酶抑制劑及其制備方法與應用，其目的是提供一種脂肪酸合酶抑制劑及其制備方法與其在以脂肪酸合酶為靶點的相關疾病的預防及輔助治療中的應用。該脂肪酸合酶抑制劑，是以地錦草為原料，用丙酮-水或乙醇-水混合溶劑浸取得到的。本發明所提供的以地錦草為原料制備的脂肪酸合酶抑制劑，具有較高的脂肪酸合酶抑制活性，本發明將在以脂肪酸合酶為靶點的相關疾病的預防及輔助治療方面，特別是在制備防治癌癥等方面的藥物中發揮巨大作用。
文檔編號A61K8/97GK102119953SQ20101054610
公開日2011年7月13日 申請日期2010年11月17日 優先權日2010年11月17日
發明者宋學英, 張英俠, 楊華, 田維熙, 趙文華, 陳月 申請人:首都醫科大學