專利名稱：一種聚乙二醇-集成干擾素變異體凍干制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種聚乙二醇-集成干擾素變異體凍干制劑，屬于藥物制劑領域。
背景技術：
早在1957年，lssacs等人發現病毒感染的細胞產生一種因子，可抵抗病毒的感染，干擾病毒的復制，因而命名為干擾素(interferon，IFN)。干擾素是由滅活的或活的病毒作用于易感細胞后，由易感細胞基因組編碼而產生的一組糖蛋白。其活性及抗原性皆取決于分子中的蛋白質，而與其糖基無關。根據其來源和結構，可將IFN分為IFN-α、IFN-β、 IFN-Y，它們分別由白細胞、纖維母細胞和活化T細胞產生。IFN-α為多基因產物，有十余種不同亞型，但它們的生物活性基本相同。IFN除有抗病毒作用外，還有抗腫瘤、免疫調節、 控制細胞增殖及引起發熱等作用。目前臨床上使用的干擾素大多是通過基因重組技術得到的。IFN是慢性病毒性肝炎經臨床驗證有效的一線治療藥物。臨床使用較多的是天然結構的IFN α - 和IFN α _2b。二者均屬于短效干擾素，半衰期短G 16 h)，血清濃度在注射M h后已經很低。其在體內的藥代動力學過程影響了其抗病毒治療的遠期療效。按照目前:T6MU/kg，每周3次的用藥方法，在體內干擾素水平呈現出典型的“峰-谷曲線”。干擾素血清水平大幅度波動容易使病毒水平反跳，產生耐藥性，降低治療效果。同時，短效干擾素存在毒副反應大，人長期使用耐受性差，免疫原性強等不足。因此，對短效干擾素進行修飾，延長其在體內的半衰期，維持體內血藥濃度的穩定，將有助于提高其治療病毒性肝炎的有效性，并減輕毒副作用。為提高天然干擾素的活性，美國Amgen公司首次合成了一種非天然的干擾素 (Consensus interferon,集成干擾素，商品名為干復津)。干復津是一種經計算機優化組合的非天然的重組α-干擾素，其序列由20種天然α-干擾素亞型序列優化組合而成，其抗病毒活性比天然干擾素提高了 5 10倍。1997年，FDA批準干復津應用于丙型肝炎的治療， 研究結果顯示療效明顯優于普通干擾素。美國專利US4695623、US4897471、US537^08公開了復合干擾素具有廣譜的干擾素活性，有較強的抗病毒和抗腫瘤以及激活NK細胞的活性。 但是干復津和天然α干擾素相同，具有穩定性差、體內半衰期短、免疫原性強等缺點。同時 N端第一位的半胱氨酸需與99位半胱氨酸形成二硫鍵，不能有效的進行N末端修飾。雖然 Amgen公司的美國專利US005985^5 A公開了和干復津蛋白的N端修飾的方法，但無論在修飾率和修飾后保留的生物活性均明顯低于其它蛋白的N末端修飾(重組人粒細胞集落刺激因子G-CSF和重組人生長激素GH等)。在干復津基礎上，根據同源序列最高原則，發明人設計了全新的集成干擾素序列， 命名為集成干擾素變異體(super antiviral interferon,簡稱IFN-SA)，現根據干擾素的命名原則改為重組集成干擾素變異體(或稱重組復合干擾素變異蛋白)。由171氨基酸組成， 在N末端專門設計引入Gly Ser Gly Gly Gly五個氨基酸序列，可實現N末端的專一位點 PEG修飾。該結構與干復津結構不同，同時體外抗病毒活性提高了 50%。本新型結構及其重組制備和在抗病毒性疾病中的應用，已獲中國發明專利授權，專利號ZL01102915. 3。然而，與其它蛋白質一樣，使用集成干擾素變異體作為藥物通常也會受到一些缺點的限制，包括免疫原性和半衰期短，其免疫原性導致中和抗體的形成以及臨床治療效果的損失，半衰期短則意味著需要對患者頻繁給藥以維持蛋白的有效治療濃度。聚乙二醇(polyetnylene glycol，PEG)是一種安全無毒、無活性的聚合物，常用于蛋白質藥物修飾。修飾后的蛋白抗酶解、水溶性增加、半衰期延長、免疫原性和毒性降低(Inadajet al.，J. Bioact . And Compatible Polymers, 5343(1990). Delgalojet al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier systems, 9:249 (1992) katre，Advanced Drug Delivery Systems, 10:91(1993))。然而，盡管干擾素-聚合物綴合物在臨床上有效，但是該類綴合物在臨床實踐中的廣泛使用，需要能夠在生產和分發給醫療機構期間的一段延長期內儲存的制劑。干燥是保持物質不致腐敗變質的方法之一，然而一些干燥方法是在0°c以上或更高的溫度下進行。 干燥后產品的理論和生物學性質會發生很大的變化，而冷凍干燥是發生在o°c以下，是指通過升華從凍結的物料中除水分或其它溶劑的過程。升華指的是溶劑，比如水，象干冰一樣， 不經過液態，從固態直接變為氣態的過程，冷凍干燥得到的產物稱作凍干物，該過程稱作凍干。在冷凍干燥過程中樣品的結構不會被破壞，因為固體成分被在其位置上的堅冰支持著， 在冰升華是，它會留下孔隙在干燥的剩余物質里，這樣就保留了產品的生物和化學結構及其活性的完整性。目前，冷凍干燥法常用于許多生物活性材料(包括多肽、蛋白質等)的保存，但是， 凍干法也有其自身的局限性，如在冷凍和除水過程中，蛋白過濃，可能會導致產物的不穩定。因此，除了在凍干狀態以及液態都可以發生的脫酰胺作用以及氧化反應外，凍干法可能導致交聯(生成共價寡聚物)以及非共價聚合物比例的升高，為了增強生物活性材料的穩定性，經常需要一些保護劑。目前，大多數注射用蛋白類生物品的保護劑通常選用人血白蛋白，而人血白蛋白價格昂貴，致使該凍干產品成本高，另外人血白蛋白具有攜帶病毒的危險。為了解決這個問題，許多人正致力于蛋白類凍干制劑的研究，嘗試以其它物質代替人血白蛋白作為凍干保護劑，如中國專利CN1260171A中選用右旋糖酐作為重組干擾素的凍干保護劑，也有用甘露醇作為凍干保護劑，在用甘露醇作為凍干保護劑時，往往會出現復溶性差、影響蛋白效應的問題，而單用右旋糖酐，對于有些蛋白，不利于其長時間保存，制劑穩定性相對較差。已知在某些狀態下氨基酸可以作為凍干蛋白產品的保護劑，據報道，谷氨酸鈉和賴氨酸鹽，對一種蛋白，乳酸脫氫酶的冷凍變性具有防凍作用(Seguro，et al.
，Cryobiology 27:70-79(1990))等其它種類的分子，包括單糖和二糖，比如乳糖和海藻糖， 以及聚合物比如PVP，也有報道作為凍干蛋白的保護劑，但對于這些二糖(乳糖和海藻糖)， 其價格昂貴，用其做低溫保護劑時成本較高。但是，由于不同蛋白質本身理化性質的差異， 對任一給定的蛋白產品，他們的效用是無法預測的。目前，上市的聚乙二醇集成干擾素變異體制劑仍然沒有，因此，需要提供一種穩定的、可供臨床方便使用、并且適宜儲存的制劑
發明內容
本發明研究人員在制備聚乙二醇集成干擾素變異體注射劑時，發現，在使用甘露醇作為凍干冷凍保護劑時，凍干產品復溶后，出現乳光，且水復溶液中，蛋白損失較大，穩定性相對也較差，不利于長期保存。本發明的目的在于提供一種穩定的聚乙二醇-集成干擾素變異體凍干制劑，并且，本發明凍干制劑復溶性好，性能更穩定，適于長期保存。本發明所述聚乙二醇-集成干擾素變異體凍干制劑，包含每毫升50至500微克的聚乙二醇-集成干擾素變異體，以及包含保持PH在4. 5-7. 5的緩沖體系、一定量的低溫保護劑，其中，所述的集成干擾素變異體是在N末端設計引入GlySerGlyGlyGly五個氨基酸序列，并在集成干擾素成熟氨基酸序列的Arg121突變為Lys121、Asp166突變為Glu1fi6。本發明中，所述的保持pH值在4. 5-7. 5的緩沖體系可以是醋酸鹽緩沖體系、碳酸鹽緩沖體系、枸櫞酸鹽緩沖體系或磷酸鹽緩沖體系。本發明中，優選的緩沖體系為磷酸鹽緩沖體系，優選的pH值范圍為6. 5-7. 5。本發明中所述的低溫保護劑為甘露醇-氨基酸體系，所述氨基酸為堿性氨基酸， 如鹽酸精氨酸或鹽酸賴氨酸，甘露醇與氨基酸的比值為4 廣2 1。本發明的研究人員發現，將甘露醇與堿性氨基酸，比如鹽酸精氨酸或鹽酸賴氨酸， 以一定比例混合后，作為聚乙二醇集成干擾素變異體凍干產品的低溫保護劑，在制備所得的聚乙二醇集成干擾素變異體凍干劑中，所得的凍干產品復溶后，不會出現乳光，并且，水復溶后，蛋白(聚乙二醇集成干擾素變異體)含量損失少，4°C保存18個月后，產品的活性保留率高，更適合長期保存。本發明所述聚乙二醇集成干擾素變異體凍干制劑，還可進一步包括穩定劑，所述穩定劑為聚山梨酯，比如聚山梨酯80，用量為0. 05-0. 20mg/ml。在凍干制劑中，加入一定量的穩定劑后，制劑穩定性可相應地得到提高。作為聚乙二醇-集成干擾素變異體綴合蛋白，所用的聚乙二醇，可以是直鏈聚乙二醇，也可以是支鏈聚乙二醇，優選為直鏈聚乙二醇，更為具體地，偶聯本發明集成干擾素變異體的聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇(mPEG)醛，如可以是單甲氧基聚乙二醇乙醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛、單甲氧基聚乙二醇丁醛，以實現對集成干擾素N末端的定點修飾，所用的mPEG的分子量范圍可以選自是5000-50000，優選為10000-20000的范圍，如可以是 mPEG12000，mPEG20000O本發明中，在作為一種凍干原液時，在用水配制后，它含有下列組分
50至500微克的聚乙二醇-集成干擾素變異體，其中所述集成干擾素變異體是在N末端設計引入GlySerGlyGlyGly五個氨基酸序列，并在集成干擾素成熟氨基酸序列的Arg121 突變為 Lys121、Asp166 突變為 Glulfi6;
保持 PH 為 6. 5-7. 5 的 NaH2PO4. 2H20-Na2HP04. 12H20 緩沖體系； 10-40mg/ml的甘露醇；
10-20mg/ml的鹽酸賴氨酸或鹽酸精氨酸，以及， 0. 05-0. 15mg/ml 的聚山梨酯 80 ；
其中，甘露醇與鹽酸精氨酸或鹽酸賴氨酸的重量比為4:廣2:1 ； 注射用水。注射液中，聚乙二醇-集成干擾素為在N末端GlySerGlyGlyGly上進行單一修飾的單甲氧基聚乙二醇-集成干擾素變異體。修飾集成干擾素的聚乙二醇，為分子量為12kDa或20kDa的mPEG。當將所得的穩定的凍干前液進行凍干后，可以得到更利于儲存是凍干粉針型注射劑。本發明的一個實施例中，研究了不同比例的甘露醇-堿性氨基酸(比如鹽酸精氨酸或鹽酸賴氨酸)低溫保護劑系統，與單一使用甘露醇作為低溫保護劑，其在復溶時，復溶效果對比，結果表明，加入一定量的堿性氨基酸后，其復溶效果明顯要強于單用甘露醇。在本發明的另一實施例中，對本發明所得的凍干產品，在4°C條件下保存M個月后，蛋白活性保留率及單聚乙二醇集成干擾素變異體含量進行對比，在穩定性方面，加入一定量的堿性氨基酸后，也要明顯強于單用甘露醇作為低溫保護劑。
實施例本發明通過下述實施例進一步闡明，但任何實施例或其組合不應當理解為對本發明的范圍或實施方式的限制。本發明的范圍由所附權利要求書限定，結合本說明書和本領域一般常識，本領域普通技術人員可以清楚地明白權利要求書所限定的范圍。在不偏離本發明的精神和范圍的前提下，本領域技術人員可以對本發明的技術方案進行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發明的范圍內。實施例1 制備 mPE&_a-IFN-SA
IFN-SA溶液(3. 5mg/ml)溶于磷酸鈉濃度為100mM，pH6. 0內含20mM NaCNBH3的溶液中， 4°C冷卻后充分混勻，加入超出4倍摩爾量的甲氧基聚乙二醇醛(mPEG-丙醛，平均分子量為 20kDa)。在反應過程中蛋白質的修飾程度用反相HPLC來監測，10小時后，反相HPLC分析結果表明，80%的N-末端具有未封閉的α氨基的蛋白質轉變成mPEG-IFN-SA衍生物。
在10小時時間點，反應混合物用水稀釋5倍，mPEG-IFN-SA衍生物的純化用離子交換層析來完成，其所用的柱為Hiload 16/10 S Sepharose HP柱，以20mM的醋酸鈉緩沖液pH5. 5加以平衡，反應混合物以lml/min的流速裝入柱內，未反應的mPEG醛以3倍于柱體積的相同緩沖液加以洗脫，然后在4°C條件下進行蛋白質-聚合物連接分子的洗脫，以 0%-75%的20mM醋酸鈉緩沖液進行線性洗脫420min，緩沖液pH為5. 5，含有IM NaCl，合并 mPEG-IFN-SA衍生物的流份，經濃縮后再過濾。 實施例2制備下列配比制成的凍干原液，并凍干成成品 Na2HPO4. 12Η20，2· 58mg/ml, NaH2PO4. 2Η20，0· 44mg/ml ；
(1)40mg/ml的甘露醇+10mg/ml的鹽酸賴氨酸；
(2)35mg/ml的甘露醇+12mg/ml的鹽酸精氨酸；
(3)30mg/ml的甘露醇+15mg/ml的鹽酸賴氨酸；
(4)40mg/ml的甘露醇；
按比例，取甘露醇、或不同比例的甘露醇-鹽酸賴氨酸、或甘露醇-鹽酸精氨酸，以PH 為6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液配制，過濾除菌，制備含不同比例的甘露醇或右甘露醇-氨基酸低溫保護劑的mPEG20kDa-IFN-SA溶液，每毫升溶液中含有mPE(i2(lkDa-IFN-SA 50-160 μ g/ ml，充分混勻，分裝為Iml/瓶，進行冷凍干燥，冷凍干燥條件是-40°C預冷凍4小時，然后于_40°C至_7°C條件下真空干燥20小時，然后逐漸升溫至10°C保持3小時，制備得到凍干制劑，保存。凍干樣品，以注射用水溶解，燈檢儀下檢測可見異物及出現乳光的現象，并用HPLC 法測定其中聚乙二醇集成干擾素變異體的量，結果見表1。表1不同凍干保護劑制成的凍干制劑成品質量檢查情況
從上表結果可以看出，當用甘露醇作為凍干冷凍保護劑時，制成聚乙二醇集成干擾素變異體凍干成品，用水復溶后，會出現乳光、可見異物以及有效成分溶出率下降等問題，而當在甘露醇中加入一定量的堿性氨基酸，比如鹽酸賴氨酸或鹽酸精氨酸，制成的凍干成品再用水復溶后，乳光消失，并且可見異物檢測符合規定，且復溶后的有效成分溶出率也明顯要得到提高。實施例3 mPEG2_a-IFN-SA凍干制劑 mPEG20kDa-IFN-SA160 μ g/ml Na2HPO4. 12H20 2. 58mg/ml NaH2PO4. 2H20 0. 44mg/ml 甘露醇 38.6mg/ml 鹽酸賴氨酸 10. 2mg/ml
制備方法和過程
按以下稀釋液配方準確配制稀釋液，配制后用于稀釋原液，所用器皿需經過無熱原處理，全過程無菌條件操作。稀釋液配方甘露醇38. 6g，鹽酸賴氨酸10. 2 g，Na2HPO4 · 12H20 2. 58 g，NaH2PO4 · 2H20 0. 44 g，注射用水準確定容至1 L，稀釋液pH到7. 2左右
取檢定合格的聚乙二醇重組集成干擾素變異體原液，精密量其體積，用稀釋液稀釋至蛋白濃度為0. 16mg/ml，無菌過濾，得半成品。將2 ml西林瓶及膠塞進行無菌無熱原處理，于半成品直接接觸的分裝機器的管道及分裝針頭等無菌無熱原處理，無菌條件下分裝半成品，每瓶裝量Iml半成品溶液，冷凍干燥，冷凍干燥條件是_40°C預冷凍4小時，然后于_40°C至_7°C條件下真空干燥20小時，然后逐漸升溫至10°C保持3小時，得成品。實施例4 mPEG20kDa-IFN-SA 凍干制劑 mPEG20kDa-IFN-SA160 μ g/ml Na2HPO4. 12H20 2. 58mg/ml NaH2PO4. 2H20 0. 44mg/ml 甘露醇 33.8mg/ml鹽酸精氨酸ll.^ig/ml
制備工藝同實施例3 實施例5
mPEGaokDa-IFN-SA160 u g/ml
Na2HP04. I2H2O2. 58mg/ml
腿2卩04.瑪00. 44mg/ml
甘露醇26. 7mg/ml
鹽酸精氨酸13. 5mg/ml
聚山梨酯800. Img/ml
制備工藝同實施例3 實施例6
mPEGaokDa-IFN-SA160 u g/ml
Na2HP04. I2H2O2. 58mg/ml
腿2卩04.瑪00. 44mg/ml
甘露醇40mg/ml
制備工藝同實施例3
將樣品以水再溶解，同時測定mPEG20k a-IFN-SA生物活性(lU/ml)、單個 mPEG20H,a-IFN-SA的純度，結果見表1，表1為不同保護劑對mPEG2(V-IFN-SA在4°C保存的 穩定性。在4°C條件下，放置M個月，將樣品以水再溶解，同時測定mPEG2(V-IFN-SA生物 活性(lU/ml)、單個mPE(^_a-IFN-SA的純度，結果見表2，測定其活性下降以及單聚乙二醇 含量變化情況，效價標示量為4. 0X 106IU/瓶，結果見表2。表2聚乙二醇化重組集成干擾素變異體注射液檢定
權利要求
1.一種聚乙二醇集成干擾素變異體凍干制劑，包含每毫升50至500微克的聚乙二醇-集成干擾素變異體，以及包含保持PH在4. 5-7. 5的緩沖體系、凍干保護劑的混合物，其中所述集成干擾素變異體是在N末端設計引入GlySerGlyGlyGly五個氨基酸序列，并在集成干擾素成熟氨基酸序列的Arg121突變為Lys121、Asp166突變為Glulfi6。
2.根據權利要求1所述的凍干制劑，其中所述凍干保護劑為甘露醇-堿性氨基酸混合體系，所述甘露醇-堿性氨基酸的質量比為4:1-1:1。
3.根據權利要求2所述的凍干制劑，其中所述的堿性氨基酸是精氨酸或賴氨酸，或鹽酸精氨酸或鹽酸賴氨酸。
4.權利要求1所述的凍干制劑，其中所述保持pH在4.5-7. 5的緩沖體系為磷酸鹽緩沖體系、醋酸鹽緩沖體系或枸櫞酸鹽緩沖體系。
5.權利要求4所述的凍干制劑，其中所述緩沖體系的pH值為6.5-7. 5。
6.根據權利要求1-5中任意一權利要求所述的凍干制劑，其中所述制劑還進一步包括穩定劑。
7.根據權利要求6所述的凍干制劑，其中所述穩定劑聚山梨酯80。
8.根據權利要求7所述凍干制劑，其中所述聚山梨酯為聚山梨酯80，所述聚山梨酯80 的用量為 0. 05-0. 2mg/ml。
9.一種聚乙二醇集成干擾素凍干制劑，在用水配制成凍干前液時，它含有下列組分 80至200微克的聚乙二醇-集成干擾素變異體，其中所述集成干擾素變異體是在N末端設計引入GlySerGlyGlyGly五個氨基酸序列，并在集成干擾素成熟氨基酸序列的Arg121 突變為 Lys121、Asp166 突變為 Glulfi6;保持 PH 為 6. 5-7. 5 的 NaH2PO4. 2H20-Na2HP04. 12H20 緩沖體系； 10-40mg/ml的甘露醇； 10-20mg/ml的鹽酸精氨酸或鹽酸賴氨酸； 注射用水。
10.權利要求9所述的凍干制劑，其中所述制劑還進一步含有0.05-0. 15mg/ml的聚山梨酯80。
全文摘要
本發明涉及一種聚乙二醇-集成干擾素變異體注射劑，所述注射劑包括每毫升50-500微克的聚乙二醇-集成干擾素變異體蛋白，以及包括保持pH在4.5-7.5的緩沖體系、由甘露醇-堿性氨基酸混合體系組成的冷凍干燥保護劑，本發明聚乙二醇-集成干擾素注射劑穩定，復溶效果好，不會出現乳光現象。
文檔編號A61K38/21GK102327242SQ20111031973
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月20日 優先權日2011年10月20日
發明者侯建華, 周德勝, 張春麗 申請人:北京凱因科技股份有限公司