專利名稱：表達禽腦脊髓炎病毒vp1蛋白重組菌的構建的制作方法
技術領域：
本發明涉及表達禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白重組菌的構建，屬于分子生物學領域， 也屬于獸用生物制品領域。
背景技術：
禽腦脊髓炎又稱流行性震顫，是由禽腦脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus, AEV)引起的一種主要侵害雛雞的傳染病，其特征性病理變化為非化膿性腦脊髓炎， 典型癥狀為運動失調，頭頸震顫和漸進性麻痹(趙振華、禹旺盛、郝憲譜等.禽腦脊髓炎的發生與診斷.內蒙古畜牧科學.1994，3 :34-37)。世界幾乎所有飼養商品雞的地區都發生過該病，我國自上世紀80年代以來各地陸續暴發此病，給養禽業帶來較大的經濟損失。由于本病具有突然出現，難以預測持續期，可通過水平接觸和垂直傳播等特點，所以對養禽業的危害非常嚴重，唯一有效辦法是通過對產蛋種雞接種疫苗來預防后代雛雞的發病。目前國內對禽腦脊髓炎疫苗的研究大多集中在滅活疫苗的研制，國外為弱毒活疫苗的研究報道。AEV是小RNA科腸病毒屬成員，基因組為單鏈正股RNA(Calnek，B. ff.，Luginbuhl， R. E.，Helmboldt, C. F. ,1997.Avian encephalomyelitis diseases of Poultry. Iowa State University Press，Ames，IA，pp. 571-581) AEV 僅有一個翻譯起點，編碼產生一個多聚蛋白，多聚蛋白在病毒編碼的活性蛋白的作用下，級聯水解成功能性蛋白，VPl是病毒的四種結構蛋白中的一種，與病毒的侵入及參與構成病毒的抗原成分有關。新加坡的Li Wei (2008)最近報道用細胞表達的VPl亞單位疫苗能有效地保護雞免受AEV的感染。他們將AEV的主要抗原蛋白VPl、VP0、VP3分別在細胞SF9中進行表達，然后純化蛋白，制成亞單位疫苗，并對VPUVPO和VP3生物活性進行了檢測，結果發現VP1是主要的抗原蛋白，能有效地保護雞免受 AEV 的感染(Wei L, Chee LL, Wei T et al. The VPl protein of avian encephalomyelitis virus is a major host-protective immunogen that serves as diagnostic potential. J Virol Methods. 2008Apr ; 149 (I) :56-62.)。完整的病原體含有許多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主產生保護性應答。其中某些抗原還能引起過敏，免疫抑制和其他副作用，這是使用完整的病原體做疫苗的缺陷。 并且目前國內應用的滅活苗生產制備抗原過程繁瑣，而弱毒疫苗現也有接種疫苗發病情況存在。而用亞單位疫苗則可以解決這個問題，尤其是這種疫苗除了具有抗原穩定性高，純度高，特異性強，敏感性高，不產生其他不相關抗體，免疫效果檢測方法方便準確外，還十分易于生產。不用動物體或是胚體生產，不會帶有組織殘留物。而且不需滅活，但安全性高。通過對禽腦脊髓炎病毒VPl cDNA全序列進行篩選和分析，選取了其中一段抗原表位較豐富、能夠在原核細胞中高效表達的cDNA序列，構建了原核表達載體，進行原核表達， 并成功地表達出可溶性的重組蛋白。利用本發明可以生產出禽腦脊髓炎亞單位疫苗，具有商業使用價值
發明內容
本發明的目的是提供一種能表達禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白重組菌的構建，得到的重組菌，以求為大規模工業化生產禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白亞單位疫苗提供生產用菌株。I.禽腦脊髓炎病毒VPl重組菌的構建本發明設計合成了能生產禽腦脊髓炎VPl蛋白的基因，這種基因含有如下核苷酸序列(序列I)5'
GAGGACAAGG AGTTGGCGAG TATGGATCTG CAGTACACAT TAAGTCTTTT CGGCATTGTA ACGTTGAACT GGATCCCTTT GGCAATTACA TTTAATGAAG GCAAGACAGT CGATGAAATT
-ATGGGGAAAG AGGATGAAGGI AGGATTTTCCAGTGTGCCTGAAGTGGAGCAACATGTTGTTAACCACAGGGACCTTTGCACGTGACACCTTTTGGCGCTGTTAAAGCCATGGAGGACCCTCGAAAACACCTGGTACATTTCCTGAATTAGCTCCTGGTAAACCTCGACACACAGTAGACCATATAAGTTTATGGGGCGTGCCCATTACTTGTGGGGACATAAATTTACCAAAACTGATATGTCCAGATACCATTGAGTCCCATCAAGGAGGGTTTTGTGACGGGAACGCTTAGGTGGTTTTCCAATTGTATCGTGGTTCTCTCGACATTACCATGACATTCGCAGGAAAGACTAATGTAGATACTTTGTGCCTGAGGGTGTTGCGATAGAGACTGAGAGGAAGGAACAGACCCCTCTGCTCACAAAACATCGGTAGGTGCCATTAGGTTTAATACTGGACAAACTACAAATGTCCAGTTTACTACACGCCACTGGAGCACATCGCAACCCATTCTAAAAACGCGATGGACTCAGTCTTGGGACTCAGATCACCAATTATAGTGCTCAGGATGAGTACCTGCAGGTCACCTACTATATCAGCATTCACAGTTTTCTGTTCCCAGAGCGGTACCAGTGGTTAGCTCATTCACTGACACATCTAGATGAATACATATTGGCTCGATGATGACGAGTTGGTGGAAGGGTCCTCCCATTTTAGTTTGAGGAGGCCCAATGTTAA-3'MetGlyLysGluAspGluGlyGlyPheSerSerValProGluValGlu
GlnHisValValGluAspLysGluProGlnGlyProLeuHisValThr
ProPheGlyAlaValLysAlaMetGlu AspProGlnLeuAlaArg Lys
ThrProGlyThrPheProGluLeuAsp ProGlyLysProArgHisThr
ValAspHisMetAsp Leu Tyr Lys Phe Met Gly Arg Ala His Tys Leu
TrpGlyHisLysPheThrLysThrAspMetGlnTyrThePheGlnHe
ProLeuSerProHeLysGluGlyPheValThrGlyThrLeuArgTrp
PheLeuSerLeuPheGlnLeuTyrArgGlySerLeuAspHeThrMet
ThrPheAlaGlyLysThrAsnValAspGlyHeValTyrPheValPro
GluGlyValAlaHeGluThrGluArgLysGluGlnThrProLeuLeu
ThrLeuAsnTyrLysThrSerValGlyAlaHeArgPheAsnThrGly
GlnThrThrAsnValGlnPheArgHeProPheTyrThrProLeuGlu
HisHeAlaThrHisSerLysAsnAlaMetAspSerValLeuGlyAla
HeThrThrGlnHeThrAsnTyrSerAlaGlnAspGluTyrLeuGln
ValThrTyrTyrHeSerPheAsnGluAspSerGlnPheSerValPro
ArgAlaValProValValSerSerPheThrAspThrSerSerLyrThr
ValMetAsnThrTyrTrpLeuAspAspAspGluLeuValGluGlySer
SerHisPheSerPheAspGluHeGluGluAlaGlnCys
為擴增如上所述的基因，本發明設計并合成了如下相應引物 primer 1:5' -GGGGAATTCATGGGGAAAGAGGATGAAGGAGGA-3,(序列 3)
primer 2:5' -GGGGTCGACTTAACATTGGGCCTCCTCAATTTC-3'(序列 4)將含有如上所述核苷酸序列的基因(禽腦脊髓炎VPl蛋白基因)連入克隆載體 PM-18T，并轉入大腸埃希氏菌DH5 α。將鑒定正確的陽性質粒pMD18_T_VPl，用ECORI和Sal I 雙酶切后，經I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，回收到VPl基因。回收的VPl基因連入pET-32a，構建成禽腦脊髓炎VPl蛋白基因的表達質粒pET-32a-VPl，轉化表達型大腸埃希氏菌Rossetta， 獲得可表達禽腦脊髓炎VPl蛋白的基因工程大腸埃希氏菌。表達載體pET_32a(+)帶有高效表達的T7啟動子，受噬菌體T7強轉錄及翻譯信號控制，能在乳糖的作用下，由宿主菌提供的T7RNA聚合酶進行誘導。構建的禽腦脊髓炎VPl蛋白表達質粒pET-32a_VPl，轉化表達型大腸埃希氏菌(Escherichia coli) Rossetta(購自博邁德公司)后構建成重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)Rossetta/ pET-32a-VPl (該菌株已于2011年12月13日送北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為；CGMCC No. 5581)加入
0.2mmol/L乳糖溶液的誘導劑，使禽腦脊髓炎VPl蛋白獲得高效表達。2.表達產物的制備(I)發酵及誘導表達將本發明中重組大腸埃希氏菌(Escherichia coii)Rossetta/pET-32a_VPl接種于含有氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C培養過夜。挑取菌落，在含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養液和大腸埃希氏菌培養基(配方為胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉I % )中培養至菌液0D600為0. 6 0. 8時，加入終濃度為0. 02M的乳糖，25 37°C進行誘導培養5 7h,然后4°C, 5000rpm離心5min,收集菌體。用PBS重懸浮菌體。(2)表達產物的鑒定將PBS重懸浮的菌體用超聲波裂解后，12000r/min離心15min，取上清加入蛋白電泳上樣緩沖液(購自北京博邁德科技發展有限公司)，沸水煮8min后，用12%的分離膠進行SDS-PAGE鑒定(圖5中，從左到右分別是蛋白marker，對照，全菌-1，全菌_2)。采用硫酸銨沉淀(每IOOml上清加5. 6g硫酸銨，4°C過夜,然后10000r/min離心IOmin,收集沉淀， 用IOmlPBS (pH7. 2)進行懸浮)、Ni_NTA對上清液進行純化(見附注I)。將用Ni-NTA純化的產物進行SDS-PAGE分析(圖6，從左到右分別是洗脫液洗脫下的第一管、第二管和第三管)。(3)重組蛋白的抗原活性檢測(參考圖7)將上述Ni-NTA親和層析純化得到的蛋白上清加入到等量的弗氏佐劑(購于sigma 公司)中制備亞單位疫苗。取I. 5mL對2月齡的試驗兔多點皮下注射免疫，在首免后28d， 56d分別用弗氏不完全佐劑(購于sigma公司)和純化蛋白制成的油乳劑疫苗加強免疫，第三次免疫7d后收集血清，用瓊脂擴散實驗檢測抗血清的活性。(圖7中，1、7為純化的VPl 蛋白；2、4、6為免疫后的兔血清；3、5為表達菌株Rossetta破碎后的上清-陰性對照)(4)表達蛋白的純化過程將收集的菌體用生理鹽水進行懸浮，置超聲波破碎菌體。加固體硫酸銨至濃度達到10%，充分溶解后4°C存放過夜。離心收集沉淀。用生理鹽水重溶沉淀，并用透析袋(北京瑞達恒輝科技發展有限公司生產，截留量14KD)進行透析。用 AGP法(張淑霞，楊增岐.禽腦脊髓炎瓊擴抗原的研制和應用.動物醫學進展，2001，22 (2) 59-60)測定回收物抗原滴度。
3.本發明所涉及重組菌表達產物制備的疫苗與其他疫苗的比較見表I。表I本發明所涉及的疫苗與現在使用的疫苗比較
權利要求
1.一種表達禽腦脊髓炎VPl蛋白重組菌的構建，其特征在于該重組菌是將含有所禽腦脊髓炎VPl蛋白基因(序列I)連入克隆載體PM-18T，并轉入大腸埃希氏菌DH5a ;將鑒定正確的陽性質粒，PMD18-T-VP1用ECORI和SalI雙酶切后，經I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，回收到VPl基因；回收的VPl基因連入pET-32a，構建成禽腦脊髓炎VPl蛋白基因的表達載體 pET-32a_VPl，轉化表達型大腸桿菌Rossetta，獲得可表達禽腦脊髓炎VPl蛋白的基因工程大腸埃希氏菌pET-32a-VPl/Rossetta株，該菌株已于2011年12月13日送交北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 5581。
2.一種由權利要求I構建成的表達禽腦脊髓炎VPl蛋白重組菌重組菌所制備的禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白亞單位疫苗，其特征在于該亞單位疫苗含有大腸埃希氏菌CGMCC No. 5581表達的腦脊髓炎VPl蛋白和常規礦物油佐劑。
全文摘要
本發明涉及一種表達禽腦脊髓炎病毒VP1蛋白重組菌的構建。本發明通過合成了禽腦脊髓炎VP1基因的引物，構建了帶有該基因的高效表達載體的重組菌，實現了禽腦脊髓炎VP1蛋白在大腸桿菌中的高效表達，可溶性蛋白表達量約占菌體總蛋白的60％。該表達產物為胞液中可溶性蛋白，具有天然VP1蛋白的抗原活性，用其制備成的禽腦脊髓炎VP1亞單位疫苗能有效地保護禽類免遭禽腦脊髓炎病毒的攻擊。這將為工業化生產禽腦脊髓炎亞單位滅活疫苗奠定了堅實的基礎。
文檔編號A61P31/14GK102586166SQ20121004649
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者劉新文, 左青山, 胡瀟, 范根成, 郭偉偉 申請人:青島易邦生物工程有限公司