專利名稱：一種甲氧基聚乙二醇-蚓激酶偶聯物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種甲氧基聚乙二醇(mPEG)蚓激酶偶聯物及其制備方法。具體而言，本發明涉及利用蚓激酶的氨基與帶有活潑功能基團的聚乙二醇衍生物反應制備得到的mPEG-蚓激酶偶聯物及其制備方法，屬于肽或蛋白質的修飾復合物及其制備的技術領域。
背景技術：
血栓性疾病的高發病率、高死亡率、高致殘率嚴重威脅人類的生存，溶栓性藥物是治療該病的首選用藥。蝴激酶(Iumbrokinase)是從新鮮蟲丘蝴體內提取的一種蛋白酶,具有直接溶解纖維蛋白的纖維酶活性，又具有類似尿激酶的纖溶酶原激活活性，因此既能溶解舊血栓又能抑制新血栓形成,是一種良好的溶栓藥物。
目前國內已有蚓激酶的腸溶口服膠囊制劑上市，用于治療腦血栓、中風后遺癥等疾病。但作為溶栓藥物，具有起效快、作用強的特點非常重要，而Fan等人(Fan Q，etal. Some features of intestinal absorption of intact fibrinolytic enzyme III—l.Biochim Biophya Acta, 2001 Jun 15 ；1523(3) :286-292)用免疫組化法研究顯示，該蚓激酶的腸溶口服膠囊只有10-15%完整的蚓激酶EFE-III-I以完整形式被腸上皮細胞吸收，證明其口服生物利用度很低。針對此問題，目前國內已有蚓激酶注射劑的研究，主要是通過進一步提取純化蚓激酶后制備成凍干粉針，但蚓激酶作為分子量2-4萬道爾頓的外源性蛋白，其靜脈應用必將引起過敏反應，同時，過敏會誘導抗體產生，影響藥效，不利于多次給藥。因此，對于蚓激酶的新型制劑研究存在迫切需要。本發明人經過研究發現，采用具有活潑功能基團的聚乙二醇衍生物與與蚓激酶反應，可以得到穩定的mPEG-蚓激酶偶聯物，從而完成了本發明。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種mPEG-蚓激酶偶聯物，其結構式如下mPEG-CH2-W-NH-Lumbrokinase
O其中mPEG是甲氧基聚乙二醇，Lumbrokinase是蝴激酶；W是 ||
一C一 O在本發明的mPEG-蚓激酶偶聯物中，mPEG分子量為5000-40000道爾頓，優選10000-20000 道爾頓。本發明的mPEG-蚓激酶是mPEG以共價鍵方式與蚓激酶連接的偶聯物。由于聚合物以具有鏈長分布的混合物制備，因此，分子量通常是指其平均分子量。比如分子量為5000-40000道爾頓的聚乙二醇是指平均分子量為5000-40000道爾頓的聚乙二醇。本發明的另一個目的是提供本發明所述mPEG-蚓激酶偶聯物的制備方法，其包括在緩沖液體系下，使具有活潑功能基團的mPEG-聚乙二醇與蚓激酶分子反應，最后加入甘氨酸終止反應，純化，冷凍干燥得到mPEG-蚓激酶偶聯物。該制備方法的反應原理是利用在緩沖液體系中，蚓激酶的伯氨基與具有活潑功能基團的mPEG-聚乙二醇可進行化學反應。在本發明中，具有活潑功能基團的甲氧基聚乙二醇可以選自甲氧基聚乙二醇玻拍酸酯(mPEG-succinimidyl succinate, mPEG-SS)、甲氧基聚乙二醇丙酸酸酯(mPEG-succinimidyl propionate, mPEG-SPA)、甲氧基聚乙二醇玻拍酸亞胺碳酸酯(mPEG-succinimidyl carbonate, mPEG-SC)、甲氧基聚乙二醇 N-輕基玻拍酸亞胺酯(mPEG-N-hydroxysuccinimide, mPEG-NHS)、甲氧基聚乙二醇琥拍酰亞胺酯(mPEG-succinimidyl ester)、甲氧基聚乙二醇對硝基苯碳酸酯(mPEG-p-nitrophenyl-carbonate)、甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯(mPEG-trichlorophenylcarbonate)、甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯(mPEG-benzolriazole carbonate)和甲氧基聚乙二醇氧擬基咪唑(mPEG-oxycarbonyIimi dazoIe)。在本發明，緩沖液體系是指pH 7. 0-9. 5的緩沖液，選自磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、碳酸緩沖液、檸檬酸緩沖液及其混合溶液，優選地PH范圍為pH 7. 2-8. 5。 在本發明的制備方法中，分離純化后的蚓激酶與具有活潑功能基團的聚乙二醇的物質的量比為I : 3 I : 30。反應的溫度為O 25°C，反應時間為l_24h，一般3h即可完成反應，反應時間一到，以甘氨酸終止反應，采用凝膠排阻法和離子交換法分離反應液，即得到mPEG-蚓激酶偶聯物。在本發明的制備方法中，由于反應混合物中各組分具有不同的等電點和分子量，因此可以采用各種色譜方法來純化得到純的mPEG-蚓激酶偶聯物，所述色譜方法如離子交換色譜、分子排阻色譜；此外，可以通過控制反應條件(包括反應溫度、時間、活性基團的種類、PEG衍生物與蚓激酶的比例、緩沖液的pH以及摩爾濃度)來獲得單修飾的mPEG-蚓激酶偶聯物。得到的mPEG-蚓激酶偶聯物的鑒定，可以采用高效液相法、SDS-PAGE等方法。本發明的一個目的是提供本發明的mPEG-蚓激酶偶聯物在制備治療心腦血管系統疾病、缺血性腦血管疾病、下肢深部靜脈血栓、中風、視網膜靜脈阻塞、突發性耳聾等疾病的藥物中的用途。所述心腦血管系統疾病包括老年人不穩定型心絞痛、冠心病心絞痛、糖尿病并發冠心病、血液流變性異常、高纖維蛋白原血癥等；所述缺血性腦血管疾病包括腦梗塞、急性腦梗塞、腦梗死后遺癥、缺血性腦血管病等。在本發明中，如果沒有特別地說明，所采用的術語都具有本領域已知的含義，所采用的物質、制備條件、反應條件、儀器、裝置等都是本領域已知的，或者是本領域技術人員根據本發明的描述結合公知常識可以獲得或得到的。本發明的mPEG-蚓激酶偶聯物的制備方法所采用的連接反應工藝簡單、易于分離產物且安全有效，制備得到的mPEG-蚓激酶偶聯物具有在體內保留時間長，降低了其免疫原性，提高了溶栓藥效。


圖I為實施例I中，蚓激酶分離純化前粗品的高效液相圖譜，從圖中可以看出，蚓激酶的主峰出現在約12. 3min，前面有幾個小雜峰，推測是一些凍干保護劑或聚合物等。圖2為實施例I中，分離純化后蚓激酶單體的高效液相圖譜，從圖中能看出，前面基本不存在小雜峰，蚓激酶主峰出現在約12. 4min。
圖3為實施例I中，用凝膠排阻法分離修飾前的蚓激酶粗品的高效液相圖譜，主要出現了兩個部分大峰，峰A和峰B，后面雜峰為一些凍干保護劑和小分子物質。對分離到的峰A和B進行體外效價測定，結果峰A代表的物質體外活性很小，峰B代表的物質體外活性大，取峰B代表的物質做下一步純化。圖4為用離子交換法對實施例I中的凝膠排阻法所得到蚓激酶峰(峰B)再次進行分離后的色譜圖。用離子交換法分離后又出現了分離程度比較好的兩個峰峰C和峰D。對兩個峰分別進行體外效價測定，結果顯示峰D代表的物質具有體外纖溶活性。圖5為對實施例I中，用凝膠排阻法和離子交換法分離純化蚓激酶粗品后得到的四個部分峰(峰A、峰B、峰C、峰D)的體外效價測定結果圖。結果表明，峰B和峰D代表的物質具有體外栓溶活性。圖6為對實施例I中，用凝膠排阻法和離子交換法分離純化蚓激酶粗品后得到的四個部分峰(峰A、峰B、峰C、峰D)的SDS-PAGE電泳結果圖，峰A的分子量很大，接近于·IOOKDa左右，推測是一些聚合物；峰B為蚓激酶峰，主要有三個條帶，一個在35KDa處，一個在25KDa處，一個在18KDa處；峰C和峰D為將峰B進行進一步離子交換分離后得到的兩個峰，峰C分子量在18KDa左右，但沒有體外活性，峰D為蚓激酶的主峰，是兩個分別在35KDa和25KDa處的條帶。圖7為實施例2中，分子量為10000的甲氧基聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺(mPEG-NHS10000)的高效液相色譜圖，mPEG-NHS10000的峰出現在約13. 3min。圖8為實施例2中，mPEG-NHS1(l_與蚓激酶反應后得到的IiiPEG-NHSicicicici-蚓激酶偶聯物的高效液相色譜圖，在12. 3min的峰為沒反應完剩余的蚓激酶峰，在13. 2min的峰為沒反應完剩余的mPEG-NHS的峰，前面10. Imin和9. 5min左右出現了兩個小峰，是mPEG-蚓激酶偶聯物的峰。圖9為實施例3-5中，用不同分子量甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEG-SC)修飾蚓激酶的電泳圖譜，分別用5KDa、10KDa、20KDa的mPEG-SC修飾蚓激酶單體，從電泳圖譜中可以看出，不同分子量的mPEG-SC修飾蚓激酶的程度都有所不同，用mPEG-SC5_修飾后，殘留的蚓激酶量最少，說明大部分蚓激酶都接上了 mPEG-SC5_，但可能分子量比較??；用mPEG-SC1(l_修飾后，有一半多的蚓激酶已接上了 IiiPEG-SCicicicici，有一個蚓激酶分子接上一個分子mPEG-SC·。。的，也有接上兩個或三個分子mPEG-SC·。。的，出現不同分子量的mPEG-蚓激酶產物；用mPEG-SC2_修飾后，出現了分子量較大的產物，蚓激酶的主峰分子量在35KDa左右，修飾產物主要都在分子量75KDa處出現，說明每個蚓激酶分子平均接上了 2個分子mPEG-SC^·，但將近一半的蚓激酶沒有被修飾。結果說明，mPEG-SC5000雖然分子量相對小，但修飾率比較高，而且有的蚓激酶分子能接上2-3個分子的mPEG-SC，使分子量增大很多，能起到一定長效循環作用；mPEG-SC1Q_分子量大小適中，進入體內之后，也具有較好的長循環作用，但修飾率在50-70%左右；mPEG-SC2(l_修飾的蚓激酶分子量最大，進入體內能起到很好的長循環作用，但修飾率相對低，因此，認為分子量為5KDa的mPEG-SC修飾蚓激酶為最佳選擇。圖10為實施例5中，將分離純化后的蚓激酶用mPEG-SC2(l_修飾后的電泳圖譜，從結果中可以看出，修飾后的主要峰在75KDa處，而蚓激酶主要峰在35KDa處，說明平均有一個分子的蚓激酶連接上了兩個分子的mPEG-SC2Q_。
圖11為實施例7中，mPEG-蚓激酶偶聯物的體外活性測定結果圖，用中國食品藥品檢定研究院的蚓激酶標準品制備標準曲線，測定蚓激酶粗品、實施例I的分離純化后蚓激酶單體、實施例3的mPEG-SC5_-蚓激酶偶聯物、實施例4的IiiPEG-SCicicicici-蚓激酶偶聯物、實施例5的HiPEG-SC2cicicicr蚓激酶偶聯物的體外活性。結果活性測定結果如下蚓激酶粗品為16000U/mg、分離純化后蚓激酶單體為19995U/mg、mPEG-SC5_-蚓激酶偶聯物為12426U/mg,mPEG-SC10000-蚓激酶偶聯物為 11114U/mg、mPEG-SC2(l(l(l(l-蚓激酶偶聯物為 9869U/mg。圖12為實施例8中，不同投料比mPEG-SC2(l_修飾蚓激酶的結果比較圖，其中a圖為用銀染法染色的結果圖，b圖為用考馬斯亮蘭染色的結果圖。從結果中可以看出，隨著投料比例增加，修飾程度也隨著變大，而最佳修飾投料比為I : 25。圖13為實施例9中，mPEG-SC2_-蚓激酶合成產物的體內活性測定結果圖，從圖 中能看出，空白模型組的黑尾程度比較嚴重；蚓激酶原料藥(對照)組的黑尾程度跟模型組相比，具有明顯改善；mPEG-SC2_-蚓激酶(藥物)組的黑尾程度與蚓激酶原料藥組相比，具有一定改善作用。
具體實施例方式給出以下實施方式旨在解釋本發明的方案，而不意味著以任何方式限制本發明。實施例I.用蛋白純化儀純化蚓激酶粗品將20mg蚓激酶用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶解，配制成濃度為10mg/mL，利用superdex75凝膠柱,用Akta Purify 10蛋白純化儀進行分子篩分離。得到兩個部分峰(峰A和峰B)，做體外效價測定，把有體外活性的峰(峰B)保留，沒有活性或活性極少的峰(峰 A)棄掉，得到的有體外活性的B峰，再用Hi Trap DEAE FF離子交換柱進行分離，分離出來兩個部分的峰(峰C和峰D)，再做體外效價測定，把有體外溶栓活性的峰(峰C)收集，冷凍干燥，最后得到的有體外活性的D峰認為是我們想要的分離純化后的蚓激酶單體峰。凝膠排阻法和離子交換色譜法分離出來的四個部分的峰都做電泳分析，查看分子量(見附圖1-6)，蚓激酶粗品分離純化后得到的純化物進行冷凍干燥，備用。實施例2. mPEG-NHS10000-蚓激酶偶聯物的制備將20mg用上述實施例I的方法進行分離純化后得到的蚓激酶，用5mM pH醋酸鈉緩沖液(pH 7. O)溶解，配制成濃度為5mg/mL，加入IOOmg的mPEG-NHS1(l_ (摩爾比為蚓激酶mPEG-NHS1Q_ = I 5)，在冰浴下(0°C )反應2h，加入甘氨酸攪拌IOmin終止反應，得到mPEG-NHS1(l_-蚓激酶偶聯物。將反應前后的溶液用高效液相檢測，進行比較。計算得到的修飾率為61. 5% (見附圖7-8)。實施例3. mPEG-SC5000-蚓激酶偶聯物的制備將5mg用上述實施例I的方法進行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶液配制成濃度10mg/ml的溶液；按蚓激酶mPEG摩爾比I : 5加入mPEG_SC5。。。，以氫氧化鈉調節pH至8. O，在25°C反應2h，加入O. 5M甘氨酸終止反應，得到mPEG-SC5_-蚓激酶偶聯物，將該偶聯物的溶液進行SDS-PAGE電泳，查看結果(見附圖9)。實施例4. mPEG-SC10000-蚓激酶偶聯物的制備將40mg用上述實施例I的方法進行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶液配制成濃度為3mg/mL，加入IOOmgmPEG-SClticicici, 4°C反應3h，加入甘氨酸攪拌IOmin終止反應，得到mPEG-SC1(l_-蚓激酶偶聯物，將該偶聯物的溶液進行SDS-PAGE電泳，查看結果(見附圖9)。 實施例5. mPEG-SC20000-蚓激酶偶聯物的制備將20mg用上述實施例I的方法進行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶液配制成濃度為5mg/mL,加入40mgmPEG-SC2_Q,室溫反應5h,加入甘氨酸攪拌IOmin終止反應。得到mPEG-SC2(l_-蚓激酶偶聯物，將該偶聯物的溶液進行SDS-PAGE電泳，查看結果(見附圖9-10)。
實施例6. mPEG-NHS30000-蚓激酶偶聯物的制備將20mg用上述實施例I的方法進行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM硼酸緩沖液(pH8. O)溶液配制成濃度為5mg/mL,加入mPEG-SC3_Q100mg,于4 反應2h后，加入甘氨酸攪拌IOmin終止反應，得到mPEG-NHS3(l_-蚓激酶偶聯物。實施例7. mPEG-蚓激酶合成產物的體外活性測定用蚓激酶標準品(購自中國食品藥品檢定研究院(140650-200502))配制不同活性單位標準品(2500U/mg、5000U/mg、10000U/mg、15000U/mg、20000U/mg)，用纖維蛋白紙板法進行體外活性測定，得到標準曲線。將蚓激酶粗品(上海國源生物技術有限公司購買)、實施例I的蚓激酶分離純化后單體以及上述實施例3-5的產物，分別測定體外活性，代入到標準曲線，得出活性。其活性值分別為蚓激酶粗品(16000U/mg)、蚓激酶單體(19995U/mg)、mPEG-SC5_-蚓激酶偶聯物(12426U/mg)、mPEG-SC10000-蚓激酶偶聯物(11114U/mg)、mPEG-SC20000-蚓激酶偶聯物(9869U/mg)。結果見附圖11。實施例8.不同投料比的mPEG修飾蚓激酶的結果比較將80mg用上述實施例I的方法進行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶液配制成濃度為5mg/mL，平均分為8份，IOmg/份，分別加入mPEG-SC2_Q，mPEG-SC2_ 與蚓激酶的投料比例分別為 I : 3、1 4、1 5、1 IOU 15、1 20、1 25、
I 30，在冰浴下((TC)反應2. 5h，最后加入甘氨酸終止反應，反應液進行SDS-PAGE電泳，分別用考馬斯亮蘭染色法和銀染法進行比較。結果見附圖12。實施例9. mPEG-SC2_-蚓激酶偶聯物的體內活性測定將500mg用上述實施例I的方法進行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶液配制成濃度為5mg/mL，加入2. 5gmPEG-SC20000,室溫反應3h，加入甘氨酸攪拌IOmin終止反應,得到mPEG-SC2(l_-蝴激酶偶聯物。配制一份5mg/mL蝴激酶原料藥,備用。將18只體重為30g左右、4周齡的雄性小鼠隨機分為3組正常對照組、蚓激酶原料藥對照組、蚓激酶-PEG藥物組，每組6只。小鼠腹腔注射角叉菜膠20mg/kg復制血栓模型，并于注射角叉菜膠前24h、lh，注射角叉菜膠后24h、48h，分別腹腔注射生理鹽水、上述蚓激酶原料藥、上述IiiPEG-SC2cicicici-蚓激酶偶聯物各一次，劑量為25mg/kg。在注射角叉菜膠后72h，觀察小鼠尾動脈血栓發生率及血栓長度，并進行比較。結果見表I、附圖13。如表I所示，蚓激酶原料藥對照組和mPEG-SC2Q_-蚓激酶偶聯物藥物組與空白組相比，血栓率和血栓長度均有顯著性差異，說明造模成功，蚓激酶-PEG藥物組與對照組相比，血栓率與血栓長度有一定改善情況，說明蚓激酶-PEG在體內發揮其長循環作用，延長體內循環時間，提高了生物利用度。表lmPEG-SC2Q_-蚓激酶對小鼠血栓發生率和血栓形成長度影響結果表(η = 5)
權利要求
1.一種mPEG-蚓激酶偶聯物，其結構式如下 mPEG-CH2-W-NH-Lumbrokinase,O 其中，mPEG是甲氧基聚乙二醇，Lumbrokinase是蝴激酶；W是
2.根據權利要求I所述的mPEG-蚓激酶偶聯物，其中mPEG的分子量為5000-40000道爾頓，優選10000-20000道爾頓。
3.根據權利要求I或2所述的mPEG-蚓激酶偶聯物的制備方法，其特征是在緩沖液體系中，使具有活潑功能基團的mPEG與蚓激酶分子反應、純化、冷凍干燥得到mPEG-蚓激酶偶聯物。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其中所述具有活潑功能基團的甲氧基聚乙二醇指甲氧基聚乙二醇玻拍酸酯(mPEG-succinimidyl succinate, mPEG-SS)、甲氧基聚乙二醇丙酸酸酯(mPEG-succinimidyl propionate, mPEG-SPA)、甲氧基聚乙二醇玻拍酸亞胺碳酸酯(mPEG-succinimidyl carbonate, mPEG-SC)、甲氧基聚乙二醇 N-輕基玻拍酸亞胺酯(mPEG-N-hydroxysuccinimide, mPEG-NHS)、甲氧基聚乙二醇琥拍酰亞胺酯(mPEG-succinimidyl ester)、甲氧基聚乙二醇對硝基苯碳酸酯(mPEG-p-nitrophenyl-carbonate)、甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯(mPEG-trichlorophenylcarbonate)、甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯(mPEG-benzolriazole carbonate)和甲氧基聚乙二醇氧擬基咪唑(mPEG-oxycarbonyIimi dazoIe)。
5.根據權利要求3或4所述的制備方法，其中所述的緩沖液指pH7.0-9. 5的緩沖液，選自磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、碳酸緩沖液、檸檬酸緩沖液及其混合溶液。
6.根據權利要求3或4所述的制備方法，其中所述的具有活潑功能基團的mPEG-聚乙二醇與分離純化后蚓激酶的物質的量的比例為I : 3 I : 30。
7.根據權利要求1-2中任一項所述的mPEG-蚓激酶偶聯物或根據權利要求3-8中任一項所述的制備方法制備得到的mPEG-蚓激酶偶聯物在制備治療心腦血管系統疾病、缺血性腦血管疾病、下肢深部靜脈血栓、中風、視網膜靜脈阻塞、突發性耳聾疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種具有生理活性的甲氧基聚乙二醇(mPEG)-蚓激酶偶聯物，具有如下結構，其中，mPEG是甲氧基聚乙二醇，Lumbrokinase是蚓激酶，mPEG的分子量為5000-40000道爾頓。本發明的mPEG-蚓激酶偶聯物，在體內保留時間長，降低了其免疫原性，提高了溶栓藥效。mPEG——CH2-W——NH-Lumbrokinase。
文檔編號A61P9/10GK102787109SQ20111012722
公開日2012年11月21日 申請日期2011年5月17日 優先權日2011年5月17日
發明者金明姬, 陳衛, 高鐘鎬 申請人:中國醫學科學院藥物研究所