專利名稱：具有抗微生物活性的模板固定的肽模擬物的制作方法
技術領域：
本發明提供了如下定義的引入12個a -氨基酸殘基的模板固定鏈的模板固定的^ -發夾肽模擬物，所述殘基根據其在鏈中的位置是Gly，或Pro，或特定的類型。這些模板固定的3-發夾模擬物具有選擇性的抗微生物活性。此外，本發明提供了有效的合成方法，通過該方法，可以根據需要以平行庫形式來制備這些化合物。這些3-發夾肽模擬物顯示出提高的功效、生物利用率、半衰期，最重要的是顯著提高的抗細菌活性(一方面)和紅細胞的溶血(另一方面)之間的比率。
背景技術：
不斷增加的微生物對已有抗生素的耐藥性問題刺激了開發具有新作用模式的新抗微生物劑的強烈興趣(H. Breithaupt, Nat. Biotechnol. 1999,17,1165-1169)。一類新興的抗生素是基于天然存在的陽離子肽(T. Ganz, R. I. Lehrer, Mol. Medicine Today 1999,5,292-297 ；R. M. Epand, H. J. Vogel, Biochim. Biophys. Actal999，1462，11-28)。這些包括二硫橋接的P -發夾和P -折疊肽(如蛋白溶菌素(protegrin) [V. N. . M. ；0. V. Shamova,H. A. Korneva, R. I. Lehrer, FEBSLett. 1993, 327, 231-236]，當素[T. Nakamura, H. Furunaka,T. Miyata, F. Tokunaga, T. Muta, S. Iwanaga, M. Niwa, T. Takao, Y. Shimonishi, Y. J. Biol.Chem. 1988，263，16709-16713]，和防御素[R. I. Lehrer, A. K. Lichtenstein, T. Ganz，Annu.Rev. Immunol. 1993，11，105-128]，兩性a -螺旋肽(例如，殺菌肽、皮抑菌肽、馬加寧和蜂毒素[A. Tossi, L. Sandri, A. Giangaspero,Biopolymers 2000, 55,4-30]),以及其他線性和環狀結構肽。盡管抗微生物陽離子肽的作用機理還沒有得到充分的了解，它們主要的相互作用位點是微生物細胞膜(H. ff. Huang, Biochemistry2000，39，8347-8352 )。暴露于這些試劑時，細胞膜經歷透化作用，接著是快速細胞死亡。然而，目前不能排除更復雜的作用機理，例如，涉及受體介導的信號傳導(M. Wu, E. Maier, R. Benz, R. E. Hancock, Biochemistry 1999,38,7235-7242)。這些陽離子肽中許多的抗微生物活性通常與其優選的次級結構相關，不管是在水溶液或是在膜樣環境中觀察到的(N. Sitaram, R. Nagaraj, Biochim. Biophys.Actal999，1462，29-54)。通過核磁共振(NMR)光譜的結構研究已經表明陽離子肽如蛋白溶菌素 I (A. Aumelas, M. Mangoni, C. Roumestand, L. Chiche, E. Despaux, G. Grassy,
B.Calas,A.Chavanieu,A. Eur. J. Biochem. 1996, 237, 575-583 ；R. L. Fahrner,T. Dieckmann,S. S. L. Harwig, R. I. Lehrer, D. Eisenberg, J. Feigon, J. Chem. Biol. 1996, 3, 543-550)和當素 I (K. Kawano, T. Yoneya, T. Miyata, K. Yoshikawa, F. Tokunaga, Y. Terada,S. J. Iwanaga, S. J. Biol. Chem. 1990，265，15365-15367)由于兩個二硫橋的限制作用而呈現出明確的￠-發夾構象。在缺乏這些二硫鍵中的一個或兩個的蛋白溶菌素類似物中，￠-發夾構象的穩定性下降，并且抗微生物活性降低(J.Chen，T. J. Falla, H. J. Liu,M. A. Hurst, C. A. Fujii, D. A. Mosca, J. R. Embree D. J. Loury, P. A. RadeI, C. C. Chang, L. Gu,J. C. Fiddes, Biopolymers2000, 55, 88-98 ；S. L. Harwig, A. Waring, H. J. Yang, Y. Cho,L. Tan, R. I. Lehrer, R. J. Eur. J. Biochem. 1996, 240, 352-357 ；M. E. Mangoni, A. Aumelas,P. Charnet, C. Roumestand, L. Chiche, E. Despaux, G. Grassy, B. Calas, A. Chavanieu, FEBSLett. 1996,383,93-98 ；H. Tamamura, T.Murakami, S.Noriuchi, K.Sugihara, A.Otaka,ff. Takada, T. Ibuka, M. Waki, N. Tamamoto, N. Fujii, Chem. Pharm. Bull. 1995,43,853-858)。對當素 I 的類似物(H. Tamamura，R. Ikoma, M. Niwa, S. Funakoshi, T. Murakami, N. Fujii,Chem. Pharm. Bull. 1993，41，978-980)和兔防御素 NP-2 的發夾-環模擬物(S. Thennarasu,R. Nagaraj, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1999, 254, 281-283)進行了相似的觀察。這些結果表明，￠-發夾結構在這些蛋白溶菌素樣肽的抗微生物活性和穩定性中起著重要作用。在偏愛a -螺旋結構的陽離子肽的情況下，螺旋的兩性結構似乎在確定抗微生物活性中起著關鍵作用(A. Tossi, L. Sandri, A. Giangaspero, A. Biopolymers2000, 55,4-30)。短桿菌肽S 是具有明確 P -發夾結構的主鏈-環肽(S. E. Hull, R. Karlsson, P. Main, M. M. woolfson,E. J. Dodson, Nature 1978, 275，206-275)，呈現出有效的對抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰 性細菌的抗微生物活性(L. H. Kondejewski, S. ff. Farmer, D. S. Wishart, R. E. Hancock,R. S. Hodges, Int. J. Peptide Prot. Res. 1996,47,460-466)。然而，短桿菌妝 S 的高 溶血活性阻礙了它作為抗生素的廣泛使用。NMR的最新結構研究表明，高溶血活性明顯與該環狀0 -發夾樣分子的高度兩性性質有關，但可以通過調整構象和兩親性而使抗微生物活性和溶血活性分離(L. H. Kondejewski, M. Jelokhani-Niaraki, S. ff. Farmer, B. Lix, M. Kay,
B.D. Sykes, R. E. Hancock, R. S. Hodges, J. Biol. Chem. 1999, 274,13181-13192 ；C. McInnesL.H. Kondejewski, R. S. Hodges, B.D.Sykes, J. Biol. Chem. 2000,275,14287-14294)。最近報道了一種來自靈長類白血球的新環狀抗微生物肽RTD-I (Y. -Q. Tang,J. Yuan, G. OSdpayj K. Osapayj D. Tran, C. J. Miller, A. J. Oellette, M. E. Selsted,Sciencel999，286，498-502)。這個肽含有三個二硫橋，其用于將環肽主鏈限制成發夾幾何。這三個二硫鍵的斷裂導致抗微生物活性的顯著損失。還報道了含有環肽主鏈，以及多個二硫橋以加強兩性發夾結構的蛋白溶菌素(J. P. Tam, C. Wu, J. -L. Yang, Eur. J. Biochem. 2000,267,3289-3300)和鱟素(J.-P. Tam，Y.-A. Lu，J. _L. Yang，Biochemistry2000，39，7159-7169 ；N. Sitaram, R. Nagarai j,Biochem. Biophys. Res. Comm. 2000, 267, 783-790)的類似物。在這些情況下，所有胱氨酸限制的去除并不總是導致大的抗微生物活性損失，但卻調整了溶膜選擇性(J. P. Tam, C. ffu, J. -L. Yang, Eur. J. Biochem. 2000，267，3289-3300)。設計新的選擇性陽離子抗微生物肽的關鍵問題是生物利用率、穩定性和降低的溶血活性。天然存在的蛋白溶菌素和鱟素對人紅細胞產生明顯的溶血活性。這種情況對于蛋白溶菌素類似物如IB367也是如此(J. Chen, T. J. Falla, H. J. Liu, M. A. Hurst,
C.A. Fujii, D. A. Mosca, J. R. Embree, D. J. Loury, P. A. RadeI, C. C. Chang, L. Gu, J. C. Fiddes,Biopolymers 2000, 55,88-98 ；C. Chang, L. Gu, J. Chen, US-Pat :5, 916, 872,1999)。該高溶血活性基本上排除了將其體內使用，并且表示臨床應用中的一個嚴重缺點。另外，類似物的抗生素活性通常隨著鹽濃度的增加而明顯下降，使得在體內條件下(約100-150mM NaCl)抗微生物活性明顯下降。蛋白溶菌素I在低和高鹽分析中呈現出對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌以及真菌的功效和類似活性。該寬抗微生物活性與快速作用模式，及其殺死耐受其它類別抗生素的細菌的能力相結合，使得它們成為開發臨床上有用的抗生素的有吸引力的目標。對抗革蘭氏陽性細菌的活性通常高于對抗革蘭氏陰性細菌的活性。然而，蛋白溶菌素I還呈現出對抗人紅細胞的高溶血活性，并且因此對微生物細胞的低選擇性。定向CD實驗(ff. T. Heller, A. J. Waring, R. I. Lehrer, H. ff. Huang,Biochemistry 1998，37，17331-17338)表明蛋白溶菌素I在與膜相互作用時可以呈現出兩種不同的狀態，而且這些狀態明顯受到脂質組成的影響。對環狀蛋白溶菌素類似物的研究(J.-P. Tam, C. ffu, J. -L. Yang, Eur.J. Biochem. 2000，267，3289-3300)已經顯示，由主鏈環化和多個二硫橋引起的構象剛性的增加可以產生溶膜選擇性，這使得抗微生物活性與溶血活性分開，至少在所研究系列的化合物中是如此。蛋白溶菌素I是具有酰胺化羧基末端和兩個二硫橋的18殘基線性肽。鱟素I含有17個殘基，也具有酰胺化羧基末端和含有兩個二硫橋。最近描述的主鏈-環狀蛋白溶菌素和鱟素類似物通常含有18個殘基和最高三個二硫橋(J. P. Tam, C. ffu, J. -L. Yang, Eur.J. Biochem. 2000，267，3289-3300 ； J. P. Tam，Y. -A. Lu，J. -L Yang，Biochemistry 2000，39，
7159-7169 ；N. Sitaram, R. Nagarai j, Biochem. Biophys. Res. Comm. 2000，267，783-790)。目前正在研究的抗菌肽(Cathelicidin) (37-殘基線性螺旋型陽離子肽)和類似物被用作囊性纖維化(CF)肺疾病的吸入治療劑(L. Saiman, S. Tabibi，T. D. Starner，P. San Gabriel，P. L Winokur, H. P. Jia，P. B. McGray, Jr.，B. F. Tack, Antimicrob. AgentandChemother. 2001,45, 2838-2844 ；R.E. W.Hancock, R. Lehrer, Trends Biotechnol. 1998，16,82-88) o超過80%的CF病人受到銅綠假單胞菌的慢性感染(C. A. Demko, P. J. Biard,P. B. Davies, J. Clin. Epidemiol. 1995,48,1041-1049 ；E. M. Kerem, R. Gold，H. Levinson,J. Pediatn 1990，116，714-719)。對抗假單胞菌的其它抗微生物肽(Y. H. Yau, B. Ho，N. S. Tan，M. L Ng, J. L Ding，Antimicrob. Agent and Chemother. 2001，45，2820-2825 和其中引用的參考文件)，如FALL-39，SMAP-29，和鱗翅目昆蟲殺菌肽呈現出較少的所需特性，如寬范圍pH內的有效抗微生物活性、快速殺死率和低溶血活性。在以下描述的化合物中，引入了新的策略來穩定呈現出選擇性抗微生物活性的主鏈-環狀陽離子肽模擬物中的￠-發夾構象。這包括將陽離子和疏水性發夾序列移植到模板上，模板的功能是將肽環主鏈限制成發夾幾何。文獻中已經描述了結合模板的發夾模擬物肽(D, Obrecht, M. Altorfer,J. A. Robinson, Adv. Med. Chem. 1999,4,1-68 ；J. A. Robinson, Syn. Lett. 2000,4,429-441),并且目前已經建立了使用組合和平行合成方法產生P -發夾肽模擬物的能力(L. Jiang,K. Moehle, B. Dhanapal, D. Obrecht, J. A. Robinson, Helv. Chim. Acta. 2000,83, 3097-3112)。國際專利申請W002/070547A1和W02004/018503A1中已經描述了抗菌的模板固定的肽模擬物及其合成方法，但這些分子沒有呈現出高的血漿穩定性選擇性和特別高的功效。

發明內容
在此所述的方法能夠合成和篩選大的發夾模擬物庫，這隨后明顯有助于結構-活性研究，并因此發現具有有效選擇性抗微生物活性和對人紅細胞非常低的溶血活性的新分子。本方法能夠合成對各種多藥物耐藥性假單胞菌菌株具有新選擇性的3-發夾肽模擬物。本發明的P -發夾肽模擬物是具有以下通式的化合物
權利要求
1.以下通式的化合物
2.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是dPix)-LPix)并且位置1-12的氨基酸殘基是 -Pl Thr ； -P2 Trp ； -P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
3.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Gly ;和 -PI2 Dab0
4.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Abu ;和 -PI2 Dab0
5.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Thr ;和 -P12 Dab o
6.根據權利要求I的通式I的化合物,其中模板是DPro-Lpro并且位置1_12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Tyr ；-P3 :Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ；-PII Ala ;和-P12 Dab o
7.根據權利要求I的通式I的化合物,其中模板是DPro-Lpro并且位置1_12的氨基酸殘基是-Pl Ala ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ；-PII Ala ;和-PI2 Dab0
8.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Lys ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
9.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Lys ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
10.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPIX)-LPIX)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -P12 :Lys0
11.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Gln ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
12.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPIX)-LPIX)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Val ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
13.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ； -P7 Dab ； -P8 Trp ； -P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Hse ;和 -PI2 Dab0
14.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是 -Pl Thr ； -P2 Trp ； -P3 Ile ； -P4 Gln ； -P5 Lys ； -P6 Dab ； -P7 Dab ； -P8 Trp ； -P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Ala ;和 -P12 :Gln。
15.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是 -Pl Glu ； -P2 Trp ； -P3 Ile ； -P4 Dab ； -P5 Lys ； -P6 DDab ； -P7 Dab ； -P8 Trp ； -P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Ala ;和 -P12 :Gln。
16.根據權利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸殘基是 -Pl Glu ； -P2 Trp ；-P3 Ile ； -P4 Gln ； -P5 Lys ； -P6 Dab ； -P7 Dab ； -P8 Ser ； -P9 Dab ； -PlO Dab ；-PU Ala ;和-P12 SerD
17.含有根據權利要求I至16任一項的化合物和藥物學上惰性載體的藥物組合物。
18.根據權利要求17的組合物，是適用于口服、局部、或注射的形式。
19.根據權利要求17的組合物，是適用于經粘膜的形式。
20.根據權利要求17的組合物，是適用于經皮、口腔或肺部給藥的形式。
21.根據權利要求17或18的組合物，是片劑、糖錠、膠囊、液體、凝膠、霜劑、膏劑、噴霧或栓劑的形式。
22.根據權利要求17或18的組合物，是溶液或懸浮液的形式。
23.根據權利要求17或18的組合物，是糖漿的形式。
24.根據權利要求I至16任一項的化合物的用途，用于制備治療或預防感染或與該感染相關的疾病的藥物。
25.根據權利要求24的用途，其中所述感染與呼吸道疾病相關；與皮膚或軟組織疾病相關；與胃腸疾病相關；與眼疾病相關；與耳疾相關；與CNS疾病相關；與骨病相關；與心血管疾病相關；與gastrourinal疾病相關；與癌癥相關；或與H IV相關。
26.根據權利要求I至16任一項的化合物的用途，作為殺菌劑或防腐劑，用于食品、化妝品和藥物。
27.根據權利要求1-16任一項的化合物的制備方法，該方法包括 Ca)將適當官能化的固體支持物與在所需終產物中處于位置5，6或7的氨基酸的適當N-保護衍生物偶聯，可存在于所述N-保護氨基酸衍生物中的任何官能團同樣得到適當保護； (b)從如此得到的產物中去除N-保護基團； (c)將如此得到的產物與在所需終產物中接近N-端氨基酸殘基的一個位置的氨基酸的適當N-保護衍生物偶聯，可存在于所述N-保護氨基酸衍生物中的任何官能團同樣得到適當保護； Cd)從如此得到的產物中去除N-保護基團； (e )重復步驟(c )和(d)直至N-端氨基酸殘基已被引入； (f)將如此得到的產物與具有以下通式的化合物偶聯
28.根據權利要求1-16任一項的化合物的制備方法，該方法包括 (a’ )將適當官能化的固體支持物與具有以下通式的化合物偶聯
全文摘要
說明書和權利要求中限定了通式(I)的模板固定的β-發夾肽模擬物及其鹽，其中Z是模板固定的12個α-氨基酸殘基的鏈，這些殘基根據它們在鏈中的位置(從N-端氨基酸開始計數)，是Gly或Pro，或是特定類型的，上述通式中剩余的符號亦是如此，該肽模擬物具有選擇性地抑制微生物如銅綠假單胞菌生長或殺滅微生物的特性。它們可以用作殺菌劑，用于食品、化妝品、藥物或其他含營養素的物質，或作為藥物，用于治療或預防感染。可以通過基于混合的固相和液相合成策略的方法來制備這些β-發夾肽模擬物。
文檔編號A61P13/00GK102796179SQ20121024558
公開日2012年11月28日 申請日期2007年1月15日 優先權日2006年1月16日
發明者F·貢貝特, D·奧伯萊希特, W·維利吉伯羅德, R·蒂亞斯, S·J·德馬科, J·A·羅賓遜, N·斯里尼瓦斯 申請人:波利弗爾有限公司, 蘇黎世大學