專利名稱：一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株的制作方法
技術領域：
本發明涉及獸醫生物制品中副豬嗜血桿菌病疫苗領域，特別是涉及一株血清4型副豬嗜血桿菌株。
背景技術：
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPs)為巴氏桿菌科嗜血桿菌屬中的一種革蘭氏陰性球桿菌，是豬的一種條件性病原菌，呈世界性分布，感染仔豬后引起以多發性漿膜炎、關節炎和腦膜炎為特征的豬格拉澤氏(Glasser’s)病。主要危害2 8周齡的仔豬，發病率一般為10% 15%，死亡率可達50%以上。副豬嗜血桿菌對營養要求苛刻，生長嚴格需要V因子(NAD)，目前認為胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養基與胰蛋白胨大豆(TSB)培養基是培養副豬嗜血桿菌的最適培養基。在添加NAD的TSA平板培養基上培養24h可見針尖大小灰白色菌落，呈隆起圓形，表面光滑、濕潤、邊緣整齊。HPs在巧克力瓊脂平板上生長困難，有報道顯示，巧克力平板上HPs不能進行傳代培養，不適用于體外傳代培養，但巧克力瓊脂平板可以用于分離該菌，初次分離培養時供給5% 10%的二氧化碳(CO2)可促進生長。液體培養時需要在肉湯或TSB培養基中添加血清與V因子(NAD)，但添加V因子濃度不斷增加細菌濃度不會隨之升高。由于葡萄球菌生長過程中會將自身代謝產物V因子釋放到培養基中，所以HPs與金黃色葡萄球菌共同接種于鮮血瓊脂平板培養，HPs在金黃色葡萄球菌兩側生長良好，隨著與金黃色葡萄球菌距離增加，菌落逐漸變小，該現象被稱為衛星現象。HPs對外界環境抵抗力極弱，體外培養極易死亡。HPs菌株間抗原性和毒力差異很大，血清學分型是區別不同菌株的重要方法之一。目前，由Kielstein等1992年提出的基于熱穩定抗原免疫擴散試驗的血清學分型方法(KRG)已在世界范圍內被接受，該方法將HPs分成15個血清型，然而有15.2% 41%的分離株血清型不能確定。根據日本、德國、美國和西班牙等國的血清流行病學調查，以血清型4、5和13最為流行。HPs在我國普遍流行，目前,在河北、河南、湖北、湖南、安徽、上海、廣東、江西等12個省市均有副豬嗜血桿菌病發生和分離 出HPs的報道。由于獸醫臨床上常常大量甚至不合理使用抗菌藥，致使豬場細菌在藥物壓力下選擇出耐藥菌群。因此，用藥物防控副豬嗜血桿菌病的難度越來越大，而且隨著人們對食品安全問題的擔憂，抗生素在防控動物疾病方面的應用會更少，而將發揮更大作用的是相應的疫苗。HPs血清型較多，且不同血清型菌株的毒力與致病力差異較大，各個血清型之間免疫交叉保護力很低，所以，現有國內外商品化的副豬嗜血桿菌病疫苗均不能對該病提供完全有效的保護。因此，分離篩選免疫原性強的通用型HPs菌株，并利用其制備高效疫苗是防控副豬嗜血桿菌病的重中之重。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株(FS0307株)，該疫苗株具有較強的毒力和很高的免疫原性。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株，其分類命名為副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis),菌株號為FS0307,已保藏于中國典型培養物保藏中心,地址:中國.武漢.武漢大學，郵編430072，保藏編號:CCTCC N0:M2013094，保藏日期:2013年3月21日。該菌株是發明人于2003年4月于河北省衡水市自行采集篩選獲得一株具有較強的毒力和很高的免疫原性的菌株。上述血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株在制備治療豬副豬嗜血桿菌病藥物中的應用。其中，所述的藥物為疫苗，優選油包水型疫苗、或水包油型疫苗、或水包油包水型疫苗。其中，血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株與藥學上可接受的載體或輔料組合構成藥物，如單價苗、多價苗或聯苗等等。其中，所述血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株在疫苗中含菌量為2X 109CFU/mL以上。有益效果:本發明的血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株具有穩定的生物學特性，對仔豬有較強的致病性，且具有良好的免疫原性。應用其制備的油佐劑滅活疫苗安全可靠，能夠產生較高水平的抗體，持續期長，并且對同源菌種攻毒的豬具有非常好的保護效果，免疫后豬群的發病率和死亡率均明顯減少，其免疫效果均達到或優于市場上現有的商品化疫苗，能夠有效預防副豬嗜血桿菌的流行。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1:血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株的分離純化和鑒定。1.生產用培養基TSA固體培養基配制:準確稱取TSA粉末40g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121 °C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至50 60°C時，加入過濾除菌的牛血清50mL、IOmL過濾除菌的0.0P/oNAD,混合均勻后倒板備用。TSB液體培養基配制:準確稱取TSB粉末30g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121°C高壓蒸汽滅菌15min，臨用前加入過濾除菌的牛血清50mL、IOmL過濾除菌的0.01%NAD即可。2.副豬嗜血桿菌分離純化及鑒定2.1分離純化2003年，我國河北地區的某規模化豬場大量出現疑似副豬嗜血桿菌感染的病豬，以持續發熱、胸膜炎、腹膜炎、關節炎等為特征，選取病豬的肺、胸水、心包液、關節液接種TSA/NAD固體培養基，置 37°C、5%C02條件下培養24 48小時，挑取半透明隆起的小菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，選取革蘭氏陰性小桿狀或多形性小桿菌，再進行兩次TSA/NAD固體培養基亞克隆培養。同時接種鮮血瓊脂固體培養基和普通瓊脂固體培養基，結果TSA/NAD固體培養基上生長良好，鮮血瓊脂固體培養基和普通瓊脂固體培養基沒有菌落生成。
2.2生化鑒定取純培養菌液接種TSA/NAD固體培養基，置37°C、5%C02條件下培養24 48小時。觀察菌落形態，可見針尖大小，圓形，邊緣整齊，扁平，灰白色半透明隆起的小菌落。取單個菌落涂片革蘭氏染色，為革蘭氏染色陰性，呈多形性，為單個小球桿菌或細長的絲狀桿菌。將純培養菌液在脫纖綿羊鮮血瓊脂固體培養基上與金黃色葡萄球菌作交叉劃線，置37°C、5%C02條件下培養24 48小時后，呈小而透明的菌落，越靠近葡萄球菌附近生長越好，呈現出典型的衛星生長現象，并且鮮血瓊脂平板上的副豬嗜血桿菌菌落周圍不出現溶血現象。將純培養菌液接種于TSA/NAD固體培養基，再分別貼上浸潰有X、V、X+V因子的圓形濾紙片。置37°C、5%C02條件下培養24 48小時，結果只有在含V、X+V因子的紙片周圍有菌落生長，表明該菌株只依賴V因子，而不依賴X因子。將純培養菌液接種微量生化反應管，分別補充終濃度0.01%的NAD，置37°C靜置培養，48h后判定生化特性結果。結果表明分離菌株對葡萄糖、蔗糖和果糖發酵，對麥芽糖、半乳糖、木糖和果糖不發酵，吲哚試驗、氧化酶試驗和脲酶試驗呈陰性，硝酸鹽還原試驗和接觸酶試驗陽性,符合副豬嗜血桿菌的生化特性。根據該菌株的來源地將其命名為FS0307株。2.316S rRNA基因序列測定與分析2.3.1引物設計根據GenBank中副豬嗜血桿菌P5基因序列設計兩條引物，引物序列為:P1:5’ -gctccacaagctaacactttc-3J，P2:5’ -catagaaacttcttttgaacc-3>,由上海生工生物工程有限公司合成，該引物擴增片段大小為1038bp。2.3.2菌體DNA模板的制備取FS0307株培養物1.5mL, 10000r/min離心5min，棄上清，沉淀用200 μ L雙蒸水 重懸，100°C水浴IOmin后，12000r/min離心5min收集上清，即為PCR模板，_20°C保存備用。2.3.3PCR擴增及測序用提取的菌體DNA作為PCR模板。PCR擴增體系為:10XPCRBuffer5.0 μ L，MgCl2 (25mM)2.5 μ L, dNTP (2.5mM)4.0 μ L，弓丨物 Pl (50 μ Μ)0.5 μ L,引物 Ρ2 (50μΜ) 0.5μ L，模板 DNA3.Ομ L，Taq 酶(5U/μ L) 0.5 μ L 加雙蒸水至 50 μ L。反應條件為:95°C預變性5min，94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，30個循環，72°C終延伸lOmin。取10 μ L PCR擴增產物，用1%的瓊脂糖凝膠在120V電壓下電泳鑒定，同時以標準株作為陽性對照，結果出現了與標準株相同的1038bp大小的特異性條帶，說明分離到的FS0307株為副豬嗜血桿菌。經過回收鑒定為陽性的PCR擴增產物交由上海生工生物工程有限公司測序。副豬嗜血桿菌FS0307株P5基因測序結果如SEQ ID N0.1所示，該序列與GenBank中公布的序列進行BLAST比對，與國內外已有的副豬嗜血桿菌相應序列的同源性達95%以上。2.4副豬嗜血桿菌FS0307株血清學鑒定按Kleletein-Rapp-Gabriedson (KRG)瓊脂擴散血清分型方法對副豬嗜血桿菌FS0307株的血清型作鑒定。將副豬嗜血桿菌FS0307株按5%的比例接種于TSB培養基，37°C、5%C02條件下培養18 24小時后，將菌液濃縮至含菌量為I X 101(lCFU/mL，菌液5000r/min離心IOmin,取上清用于瓊脂擴散試驗的分型抗原。配制1%瓊脂平板,打孔(中間I個孔周邊6個),孔徑5.0mm,孔距3.0mm。。在周邊的6個孔內加入6 μ I副豬嗜血桿菌標準株兔抗高免血清(正上方孔標記為I,加I型高免血清,其余各個血清型的血清依次按血清型遞增順序以順時針的方向加樣)，中間孔加待檢菌株的熱處理分型抗原6 μ 1，濕盒37°C孵育，分別在24h、48h、72h觀察并記錄結果，同時設標準菌株的對照。瓊脂擴散試驗表明，副豬嗜血桿菌FS0307株的高壓提取抗原只與4型副豬嗜血桿菌標準株的陽性血清有沉淀線，與其它型標準株的血清型無沉淀線，說明副豬嗜血桿菌FS0307株為血清4型。2.5動物攻毒試驗血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株經TSB/NAD液體培養基培養，進行活菌計數，濃縮后，使感染滴度達到lX109CFU/ml，經腹腔注射50 60日齡健康易感豬5頭，5ml/頭。另設I組對照組，5頭，腹腔注射TSB/NAD培養基，5ml/頭。攻毒后按常規飼養，飼料中無抗生素。觀察14日，每日測體溫，觀察臨床癥狀。攻毒14日后剖檢，根據臨床癥狀與剖檢病變計算發病數。同時，取發病豬的組織病料做細菌分離和鑒定。攻毒結果顯示，連續觀察14日后，血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株攻毒組的5頭實驗豬均先后發病；對照豬表現正常。臨床癥狀表現為，實驗豬感染副豬嗜血桿菌分離株I日后體溫升高，隨后逐漸出現食欲降低，被毛粗亂，耳朵及全身皮膚發紅，鼻液增多，后期出現呼吸困難，關節腫脹，臥地不起。剖檢發現，發病豬和病死豬出現胸腔、腹腔積液，有不同程度的胸膜、腹膜粘連，關節腫脹、關節腔粘液增多，肺臟出血，淋巴結腫脹等病變。結果見表I。 利用分離菌株攻毒的組織病料進行細菌分離。結果從FS0307株攻毒組中的4頭發病豬中分離到菌落和菌體形態與副豬嗜血桿菌標準株相似的細菌。同時對所有分離到的細菌進行PCR鑒定，結果在1038bp處出現特異性條帶，證明分離病原為副豬嗜血桿菌。表I副豬嗜血桿菌FS0307株的毒力試驗結果..
權利要求
1.一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株，其分類命名為副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)，菌株號為FS0307，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號=CCTCCN0:M2013094，保藏日 期:2013年3月21日。
全文摘要
本發明涉及獸醫生物制品中副豬嗜血桿菌病疫苗領域，公開了一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株，其分類命名為副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)，菌株號為FS0307，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NO:M2013094，保藏日期2013年3月21日。本發明的血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株對豬有較強的致病性，具有良好的免疫原性，應用其制備的滅活疫苗安全可靠，對同源菌種攻毒的豬具有非常好的保護效果，免疫后豬群的發病率和死亡率均明顯減少。無論是單苗還是聯苗，其免疫效果均達到或優于市場上現有的商品化疫苗，能夠有效預防副豬嗜血桿菌的流行。
文檔編號A61P31/04GK103194413SQ20131012619
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月11日 優先權日2013年4月11日
發明者邵國青, 劉茂軍, 周勇岐 申請人:江蘇省農業科學院