專利名稱：人工抗原的制備——半抗原與蛋白質交聯的新方法
技術領域：
本發明涉及利用新型的橋結構L-賴氨酸或多肽及新型有機磷縮合試劑將有機磷化合物半抗原與載體分子(蛋白質)交聯的制備人工抗原的方法，屬生物有機大分子的制備技術領域。
在化學免疫及有關研究領域中為使無免疫原性的小分子物質(通常稱為半抗原，Hapten)能在動物體內誘發產生抗體，常要將這種半抗原與某種大分子載體如蛋白質、多肽、或多糖等經化學交聯共價結合而成為人工抗原。將人工抗原作為免疫原注射到動物體內會誘發產生抗體。這種抗體經過提純后做為疫苗注入人體或動物體后，即可抗某種藥物或病毒，這種過程叫化學免疫，它是當前醫學、藥理及生物工程研究(催化抗體)中最活躍的領域之一。化學免疫中的關鍵就是人工抗原的制備，過去關于此方面的報導較多，比較成熟的交聯方法包括重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二異氰酸酯法、鹵代硝基苯法等，這些方法缺點在于所采用的橋結構(即半抗原與蛋白質的聯結部分)均為人工合成的有機物，有些化合物的結構還會對誘發抗體的產生有一定的影響。近來又發現了一些用多肽做為橋結構進行聯接，但所采用的方法比較陳舊，選擇的催合劑付產物多，難純化，方法掌握也比較困難，特別是對于將含磷化合物的半抗原交聯到載體分子上，一直是目前在人工抗原制備領域的一個難點。過去的方法多采用重氮化法，最近也有關于用His-Cys做橋結構的報導，但國內有些單位重復實驗一直未能成功。
將半抗原上的羧基與蛋白質上的側鏈氨基交聯制備抗原的方法是一種常見的方法，但過去采用的一種是用水溶性脫水劑(EDC)，此方法選擇性差，易形成蛋白分子之間的交聚。現逐漸為活潑酯法所代替。活潑酯法就是先將羧基與N-羥基琥酰亞胺縮合制成活潑酯，再與蛋白質分子交聯。過去多用二環已基碳酰亞胺(DCC)做為脫水劑，由于生成的付產物DCU很難除去，影響了活化酯的純度及進一步與蛋白質的交聯。
本發明的目的就是尋找一個適當的橋結構，并選擇一條簡便、實用、易操作、產率高、純度好的新型人工半抗原的制備路線，使之適合各類含磷化合物半抗原與載體分子的交聯。
本發明的內容包括1.選擇了天然有機物L-賴氨酸做為橋結構。由于它存在于所有生物體內，從而克服了一些人工合成化合物的引入帶來的不利影響，它適合各類有機磷半抗原與載體分子的聯接，也可用于其它有機物半抗原與載體的交聯。
2.設計了新型的人工抗原的結構模型，這種模型不僅制備容易，而且具有很強的誘發產生抗體的能力。
3.選擇了一種新型有機磷的縮合劑如EDCP、DECP、DEPH等及縮合方法及合成路線。
人工抗原的合成路線如下
其中X＝烷氧基、烷基、芳香基等Y＝烷氧基、氰基、胺基、羧基、氧負離子等Z＝H、Cl、Br、F。
HOSu＝N-羥基琥珀酰亞胺制備通法一、化合物C的制備首先將L-賴氨酸或多肽b溶解于水～乙醇(二者體積比為1∶1)的溶液中，再加入與L-賴氨酸或多肽b成摩爾比為1∶2-3的三乙胺，冷卻至0℃～-5℃。然后將有機磷化合物的半抗源a溶解于有機溶劑如四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、四氯呋喃、二氧六環等溶劑中，將該混合溶劑慢慢滴加到上述混合液中，反應2～12小時后，用濃度為1N的無機酸酸化到PH＝3。最后用乙酸乙酯或乙酸乙酯-叔丁醇萃取，干燥，減壓濃縮，即得到產物C。
二、活潑酯d的制備將上述濃縮物C溶于干燥的乙酸乙酯，或四氯呋喃或二氧六環中，加入與濃縮物C等摩爾的N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)，再加入稍過量的三乙胺，冰水冷卻下加入縮合劑，縮合劑可為0-乙基二氯磷酸酯(EDCP)，或0.0-二乙基氯磷酸酯(DECP)或二乙基亞磷酯(DEPH)。反應5-12小時后，溶液用弱堿水洗幾次后干燥，即得到活潑酯d。
三、人工抗原e的制備(即半抗原與蛋白質的交聯)將蛋白質(或酶、糖)溶于水和二甲基甲酰胺(DMF)的溶液中，再加入與蛋白質(或酶、糖)等摩爾的三乙胺。加入由上述第二步制得的活潑酯d，在0℃～-10℃反應過夜，溶液在蒸餾水中于4℃下透析3天，每天換三次水，冷凍干燥，得到固體e人工抗原。
本方法可在水體系中直接將半抗原含磷化合物a與橋結構化合物b聯接。半抗原可以為各種結構的含磷化合物。
實例二異丙基亞磷酸酯即DIP及沙林的人工抗原的制備1.Na、Ne-二(二異丙基磷酰基)L-賴氨酸20mmol(2.92g)L-賴氨酸溶于5ml水，5ml乙醇及8ml三乙胺中，冷至0℃，加入二異丙基亞磷酸酯(DIP，40mmol，6.6g)及5ml四氯化碳，反應2-1小時，除去有機溶劑，水層酸化至PH＝3，用乙酸乙酯萃取，干燥，酸化后除去溶劑即得到無色油狀物，重5.2g，產率55%。
結構測定分子式C18H40N2P2O831P-NMR(EtOAc) 8.26ppm，6.53ppm1H-NMR(CDC13) δ1.0-1.5(m，30H)，2.8-2.9(brs，2H)，3.0-3.3(bs，2H)3.6-3.8(s，1H)，4.3-4.6(m，4H)，11.5(s，1H)FAB-MS m/e MH+475元素分析實測值 C 45.88， H 8.38， N 5.85計算值 C 45.56， H 8.44， N 5.912.Na、Ne-二(二異丙基磷酰基)L-賴氨酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯將磷酰化賴氨酸(3.0mmol，1.4g)溶于乙酸乙酯中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(3.2mmol，0.4g)，常溫下加入4ml三乙胺，冷至0℃，滴加0.5g(3.0mmol)EDCP，反應6小時，溶液用飽和碳酸氫鈉水溶液洗5次(10ml×5)，再用水洗2次(10ml×2)，有機相用無水硫酸鎂干燥，減壓除去溶劑得到淺黃色油狀物，重1.0g，產率58%。
結構測定分子式C22H43N3P2O1031P-NMR(EtOAc) 8.91ppm，6.24ppm1H-NMR(CDC13) δ1.1-1.3(m，30H)，2.0(s，4H) 2.8-2.9(brs，2H)，3.0-3.3(bs，2H)，3.6-3.8(s，1H)，4.3-4.6(m，4H)。
FAB-MS m/e MH+5723.磷酰化賴氨酸與牛血清白蛋白(BSA)的交聯(DIP-BSA人工抗原)將牛血清白蛋白(BSA，0.3g)溶于8ml水，4ml二甲基甲酰胺(DMF)及4ml三乙胺中，在0-4℃滴加磷酰化賴氨酸N-羧基琥珀酰亞胺酯(0.8g)的5mlDMF，慢慢攪拌16個小時，將溶液裝入透析袋中，將入2升蒸餾水中在4℃下透析三天，每天換三次蒸餾水，透析完畢，冷凍干燥，得到固體蛋白(0.3)，于-20℃冷凍保存。
31P-NMR(H20) 10.3ppm，8.2ppm4.磷酰化賴氨酸與血蘭蛋白(KLH)的交聯(DIP-KLH人工抗原)方法同上，得到淺蘭色蛋白，低溫保存。
a1P-NMR(H20) 10.0ppm，8.2ppm化學免疫實驗1.免疫過程將人工抗原DIP-KLH分別溶于0.9%的氯化鈉水及福氏佐劑(FCA or FIA)中，然后等體積混合乳化后備用。
將體重在2.5-3.0Kg的同姓別的新西蘭白兔籠養一段時間后，進行五次免疫，第一次在第一天進行，按20mg/Kg體重注射DIP-KLH抗原的FCA乳化液，10天后，進行第二次免疫，從白兔的后腳掌注射0.4mlFIA乳化液(含0.2mgDIP-KLH)，然后每間隔一個月進行第三和第四免疫注射，500微克DIP-KLH的1mlFIA。一個月后，經過耳靜脈血管放血及滴定度測定，再進行最后一次免疫，從耳部注射2mgDIP-KLH的0.2ml 0.9%NaCl溶液。7天后放血，高速離心除去紅細胞，收集血清，冷凍備用。
2.抗體純化將兔血清用33%硫酸胺兩次沉淀后得到免疫球蛋白，用0.01mol/L磷酸緩沖液(PH 7.2)透析，剩下的抗體再用蒸餾水透析，用0.22μm膜過濾滅菌后，冷凍干燥，在-20℃保存。
酶的免疫分析將DIP-BSA用0.05mol/L碳酸緩沖液(PH 9.6)稀釋到蛋白濃度為10.0μg/ml，準備一個96槽的聚苯乙烯微升板，每槽加入200μl上述溶液，然后在4℃放置過夜，接著用PBS-Tween洗三次，(PBS 10mml/L，0.05%Tween-20，PH 7.2)首先測定抗血清滴度，將一系列不同濃度的血清樣品各取100μl加入到裝有DIP-BSA的小槽中，37℃保溫1小時，用PBS-Tween洗三次，三十分鐘后，加入100μl稀釋千分之一的GAR-HRP(免疫球蛋白的辣根過氧化物酶輔劑)后再加入100μl四甲基聯苯胺(TMB)的底物溶液(100μlTMB及15μl30%過氧化氫，溶于10μl磷酸緩沖液，0.1ml/L，PH 6.0)，在室溫下暗處反應30分鐘，再加入50μl20μl/L的硫酸，在450nm處測定每個原子的吸光度，抗體的滴度可用血清的稀釋率與50%最高吸光度值的對應關系標定出來，并可進一步用競爭性抑制酶的免疫分析。
類似方法可以測定亞磷酸二異丙酯(DIP)和沙林(一種很強的膽堿酯酶抑制劑，用于化學戰劑)的抑制率，對DIP和沙林的最低檢出濃度分別為10-6和10-5摩爾每升。
權利要求
1.一種新人工抗原的制備方法，其特征在于該制備方法采用如下合成路線 其中X=烷氧基、烷基、芳香基等Y=烷氧基、氰基、胺基、羧基、氧負離子等Z=H、Cl、Br、F。HOSu=N-羥基琥珀酰亞胺制備通法一、化合物C的制備首先將L-賴氨酸或多肽b溶解于水～乙醇(二者體積比為1∶1)的溶液中，再加入與L-賴氨酸或多肽b成摩爾比為1∶2-3的三乙胺，冷卻至0℃～5℃。然后將有機磷化合物的半抗源a溶解于有機溶劑如四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、四氯呋喃、二氧六環等溶劑中，將該混合溶劑慢慢滴加到上述混合液中，反應2～12小時后，用濃度為1N的無機酸酸化到PH=3。最后用乙酸乙酯或乙酸乙酯-叔丁醇萃取，干燥，減壓濃縮，即得到產物C。二、活潑酯d的制備將上述濃縮物C溶于干燥的乙酸乙酯，或四氯呋喃或二氧六環中，加入與濃縮物C等摩爾的N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)，再加入稍過量的三乙胺，冰水冷卻下加入縮合劑，縮合劑可為0-乙基二氯磷酸酯(EDCP)，或0.0-二乙基氯磷酸酯(DECP)或二乙基亞磷酯(DEPH)。反應5-12小時后，溶液用弱堿水洗幾次后干燥，即得到活潑酯d。三、人工抗原e的制備(即半抗原與蛋白質的交聯)將蛋白質(或酶、糖)溶于水和二甲基甲酰胺(DMF)的溶液中，再加入與蛋白質(或酶、糖)等摩爾的三乙胺。加入由上述第二步制得的活潑酯d，在0℃～-10℃反應過夜，溶液在蒸餾水中于4℃下透析3天，每天換三次水，冷凍干燥，得到固體e人工抗原。
全文摘要
本發明涉及一種新型的人工抗原的合成方法，將半抗原(主要是指含磷化合物)先鍵合在L-賴氨酸或多肽上制成磷酰化賴氨酸或多肽酸，再用縮合試劑EDCP與N-羧基琥珀酰亞胺反應制備出活化酯，最后在水體系中與蛋白質載體交聯，此方法操作簡便，易于掌握，收率較高，適合于含磷化合物半抗原與蛋白質的交聯，也可推廣到其它類型半抗原的交聯。
文檔編號A61K39/385GK1104216SQ9410504
公開日1995年6月28日 申請日期1994年5月13日 優先權日1994年5月13日
發明者趙玉芬, 閻慶金 申請人:清華大學