專利名稱：微小rna的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，尤其是微小RNA的新用途，即miR-17-5p和miR-20a 的新用途。
背景技術：
髓系抑制細胞(MDSCs)作為免疫抑制系統的重要組成部分在免疫應答中發揮廣 泛的免疫抑制作用，尤其是T淋巴細胞。MDSCs在小鼠細胞特征性表達Ly 6C/G和CDllb表 面分子，而在人類細胞特征性的表面分子為⑶llb+CD33+HLA-DR_。小鼠⑶llb+Gr-Γ細胞通 過形態學、分子組成和功能學三方面分成了兩個亞型單核細胞型(MO-MDSCs)類似炎癥性 的單核細胞，表達Ly6C標記；低密度的多形核白細胞型(PMN-MDSCs)類似不成熟的白細胞， 表達Ly6G標記，它們都對T淋巴細胞有抑制作用。近年來研究發現腫瘤患者體內大量積聚 MDSCs,因此清除和改變MDSCs的功能成為近年來的研究熱點。然而調節MDSCs功能的合理 機制始終難解，一些研究證實MDSCs調節JAK2-STAT3通路。STAT3 (信號傳導子和激活子 3)轉錄因子使MDSCs擴增并且增加了小鼠腫瘤的免疫耐受。因此，抑制或沉默STAT3可以 抵抗MDSCs的作用從而促進機體對于腫瘤的免疫應答。
小干擾RNAs (MicroRNAs，miRNAs)是一類短小的非編碼RNA。MicroRNAs這種非 編碼調控RNA，是由機體自我產生，具有18-25個堿基，主要通過與靶基因信使RNA (mRNA) 3’ 非翻譯區(3’ -UTR)配對結合來實現對基因的調控。在生理和病理條件下，MicroRNAs在 細胞增殖、細胞死亡、細胞分化發育、新陳代謝、病毒感染和腫瘤中均發揮著重要作用。許 多克隆于小鼠骨髓細胞的MicroRNAs調節著造血系統，同時MicroRNAs對于免疫細胞的發 育，固有免疫和適應性免疫起著決定性作用。MicroRNAs選擇性的或高表達于免疫細胞，例 如miR-17 92，miR-155，miR-181和miR-223在骨髓和淋巴細胞的成熟、增殖、分化過程中有 “允許”作用。
腫瘤是危害人類身體健康的首要疾病之一，據報道癌癥患者的平均生存率僅為5 年，而癌癥治愈率只有20% -30%左右。過去十年我國雖然在腫瘤的防治方面取得了很大 進展，出現了許多新技術新方法，發展了多種抗腫瘤免疫治療，但到目前為止，這些方法遠 沒有達到人們的預期效果，一個重要的原因就是缺少生物治療。目前腫瘤治療中發展最為 迅速的一個領域是靶向藥物治療，被大家廣泛重視，同時基因治療代表著未來腫瘤防治方 向。發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供miR-17_5p和miR-20a的新用途。通過沉默 STAT3，miR-17-5p和miR_20a減輕了 MDSCs的免疫抑制，成為作為制備應用miRNA免疫治 療作用的藥物來治療一些疾病特別是腫瘤的切入點。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案是
miR-17-5p具有抑制髓系抑制細胞積聚的用途。3
優選的，所述miR-17_5p通過阻礙髓系抑制細胞(MDSCs)的積聚從而具有抑制腫 瘤生長的用途。
優選的，所述腫瘤為結腸癌、肺癌或卵巢癌。
優選的，所述miR-17_5p在制備通過調節免疫細胞的表達抑制髓系抑制細胞積聚 以抑制腫瘤生長的靶向藥物中的用途，即制備以miR-17-5p為靶點的藥物來抑制腫瘤生長。
優選的，所述miR-17-5p在制備通過調節免疫細胞抑制結腸癌、肺癌或卵巢癌生 長的靶向藥物中的用途。
miR-20a具有抑制髓系抑制細胞積聚的用途。
優選的，所述miR-20a通過阻礙髓系抑制細胞(MDSCs)的積聚從而具有抑制腫瘤 生長的用途。
優選的，所述腫瘤為結腸癌、肺癌或卵巢癌。
優選的，所述miR-20a在制備通過調節免疫細胞的表達抑制髓系抑制細胞積聚以 抑制腫瘤生長的靶向藥物中的用途，即制備以miR-20a為靶點的藥物來抑制腫瘤生長。
優選的，所述miR-20a在制備通過調節免疫細胞抑制結腸癌、肺癌或卵巢癌生長 的靶向藥物中的用途。
本發明的有益效果是
本發明利用現代生物學技術和生物信息學分析對miR-17_5p和miR-20a的功能 進行了初步研究，發現miR-17-5p和miR-20a具有抑制MDSCs的功能，進而發現miR-17_5p 和miR-20a具有抑制腫瘤生長的用途，可以將miR-17_5p和miR-20a設計為靶向藥物來治 療腫瘤，對腫瘤臨床免疫治療有著潛在的巨大應用價值，并且為進一步研究miR-17-5p和 miR-20a的生物學功能奠定了基礎。


圖 1 是miR-17-5p 和 miR_20a 結合于 STAT3 3，UTR ；
圖 2 是miR-17-5p 和 miR_20a 調節 STAT3 的表達；
圖3是在體外，miR-17-5p和miR_20a減輕MDSCs的抑制作用；
圖4是在體內，miR-17_5p和miR_20a減輕MDSCs的抑制作用，其中Al-大小、 A2-重量、A3-體積，Bl-重量、B2-體積；
圖5是腫瘤相關因子調節miR-17_5p和miR-20a的表達，其中圖5B1顯示的是成 熟miR-17-5p的表達水平，圖5B2顯示的是成熟miR-20a的表達水平，圖5B3顯示的是STAT3 mRNA的表達水平；
圖6是本研究中所用引物。
具體實施方式
為了使本領域的技術人員更好的理解本發明的技術方案，下面結合附圖及具體實 施方式對本發明所述技術方案作進一步的詳細說明。
實施例1
構建腫瘤小鼠模型、BMCs的制備以及miRNA基因和3’ -UTR的表達構建4
(1)腫瘤鼠模型的建立
使用4-6周的雌性的BALB/C鼠和C57BL/6鼠和裸鼠(北京動物中心)，實驗前一 周將鼠飼養在不存在對鼠致病的病原體的環境內，保證鼠處于病原體免疫狀態。實驗構建 了 s. c.腫瘤模型(靜脈注射腫瘤模型)，包括在BALB/C鼠內構建CD6結腸癌(ATCC)模 型，以及在C57BL/6鼠體內構建Lewis肺癌模型(ATCC)和1D8卵巢癌模型(Ruby，Texas大 學)。鼠皮下一次性注射100微升PBS (磷酸鹽緩沖液)，內含5 X IO5腫瘤細胞。模型構建 時每個模型所注射的腫瘤細胞的數量是以在注射后3-4周內能形成一直徑約為1. 5厘米的 腫瘤為依據的。
(2)細胞系和髓系抑制細胞的準備。
實驗所需要的人的胚胎腎細胞系HEK493 T細胞，鼠的單核白細胞/巨噬細胞系 RAW264. 7和人的單核白細胞系U937均是從美國型培養菌種集(ATCC)購買的。鼠的髓系 抑制細胞(MDSCs)從骨髓細胞(BMCs)誘導獲得，從模型鼠的股骨中收集BMCs，室溫下懸浮 于aiilACK緩沖液5分鐘，使紅細胞裂解。T細胞和B細胞通過磁力珠進行選擇，選擇完成之 后，⑶4 T細胞，⑶8 T細胞和B細胞與BMCs的比例不超過1%。除非特殊說明，以下實施例 中所使用的BMCs均為經過上述選擇獲得的細胞。MDSCs從這些獲得的BMCs誘導獲得。首 先在M孔板內，37°C，5% C02的條件下，處理單核白細胞-粒細胞集落刺激因子(GM-CSF ； 20ng/ml)五天，在含有RPMI1640媒介和3% FCS，1 %青霉素和鏈霉素，以及經過處理的白 細胞-粒細胞集落刺激因子(GM-CSF ;20ng/ml)和IL-4(10ng/ml)的M孔轉染板內，再將 5 X IO4的CT-26，Lewis或1D8腫瘤細胞分別與2 X IO6BMCs共培養。收集細胞并用流式細 胞儀進行分析。
鼠的MDSCs同樣按照制造商(Miltenyi Biotech)提供的方法步驟使用Gr-1抗體 和LS柱的免疫磁珠從CD6腫瘤模型鼠的脾臟中分離獲得，再使用抗Gr-I和CDllb抗體染 色后使用流式細胞分選進行分類。具體實現上，殺死CD6結腸癌模型鼠，以無菌注射器分 別從小鼠的脾臟和血液中獲取細胞，使用水破壞紅細胞，并進行血清封閉。用:3mlPBS懸浮 細胞，首先加入⑶8+T淋巴細胞、⑶4+T淋巴細胞和B淋巴細胞的抗體30 μ 1，在冰上靜置15 分鐘后，用PBS洗一遍；之后加入⑶4+Τ淋巴細胞、⑶8+Τ淋巴細胞和B淋巴細胞的陽性選定 的磁珠(MACS) 35 μ 1，冰上靜置30分鐘，用PBS洗兩遍，得到不含⑶8+淋巴細胞、⑶4+Τ淋巴 細胞和B淋巴細胞的BMCs。提純的脾的MDSCs 90%以上為Grl+⑶Ilb+細胞。
從脾臟制備單細胞懸液，使用ACK緩沖液除去紅細胞。在使用這些單獨的細胞前， 轉染這些Grl+細胞并在腫瘤上清液中培養M小時。
(3)miRNA、siRNA 和 3' -UTR 的表達構建
從廣東銳博生物公司購買miR-17-5p mimics 和 miR_20a mimics, miR-17-5p 的抑制物，miR-20a的抑制物以及miRNA抑制物的陰性對照。從廣東銳博生物公司購買 STAT3 siRNA和siRNA陰性對照。從hvitrogen公司購買空白iT熒光寡核苷酸。從Open biosystem 公司購買 pCMV-SP0RT6/STAT3 完全編碼序列(cDNA clone ID :3593588 Catalog No :MMM4769_99609717)的表達載體，此編碼序列中包含一個miR-17_5p and miR_20a種子 序列的3’ UTR。使用引物，將鼠的基因組中的Pri-miR-17-5p和Pri_miR-20a基因于Hind III和Xho I位點克隆到pcDNA3. 1表達載體上。獲得的構造物稱為pcDNA3. l-miR-17_5p 和 pcDNA3. l-miR-20a。
通過PCR(聚合酶鏈式反應)的方法從鼠脾臟細胞的基因組DNA克隆STAT的 3，UTR,并將其在Me I和^CbaI位點連接到pIS2熒光素酶報告載體(Addgene)上。通過 PCR的方法構建了 STAT3的3 ‘ UTR的突變體，突變體經過質粒DNA測序進行確認，在圖六 中列出了實驗中所用的引物。
如圖IAl所示，設計了 4種不同的引物并通過PCR的方法構建STAT的3’-UTR的突 變體(Mut) 1、突變體2。如圖1A2所示，構建的熒光報告質粒包括種子序列1 (156-162，STAT3 3，UTR1)、種子序歹Ij 2(403-409, STAT3 3，UTR2)、突變種子序列 1 (STAT3 3，UTRl Mut)、突 變種子序列2(STAT3 3，UTR2 Mut)、種子序列1和種子序列2 (STAT3 3，UTR1+2)、突變種 子序列1和種子序列2(STAT3 3，UTRl Mut+2)或者種子序列1和突變種子序列2 (STAT3 3，UTRl+2Mut)。
PCR 條件
IOX擴增緩沖液IOul
4 種 dNTP 混合物各 200umol/L
引物各 10 IOOpmol
模板 DNA 0. 1 2ug
Taq DNA 聚合酶 2. 5u
Mg2+ 1. 5mmol/L
加雙或三蒸水至IOOul
實施例2
驗證miR-17-5p 和 miR_20a 與 STAT3 3，UTR 的綁定關系
應用熒光素酶報告基因來分析驗證miR-17-5p和miR-20a與STAT3 3'UTR的綁定 關系。對于轉染的腎(人胚腎)293T細胞，轉染前一天用250毫升細胞密度為4X104的培 養基將細胞在48孔板進行鋪板，按照說明書，將細胞與表達質粒、海腎熒光素酶報告質粒 和對照質粒(ftOmega)用脂質體2000 (Invitrogen公司)進行共轉染，通過轉染后24小時 使用雙熒光素酶試劑盒測定海腎和螢火蟲熒光素酶的活動，海腎熒光素酶的活性根據螢火 蟲熒光素酶活性進行標準化并進行統計分析，統計分析采用檢定的方法，95%的置信限度 被認為是有意義的，*(單一星號)P < 0. 05，**(雙星號)P < 0. 01。轉染了抑制劑陰性對 照的細胞作為對照組(Ctr.)，有pLS2-REP0RT-STAT3 3，UTR和miRNA對照結構物(miRctr) 的活性直接被設定為1。
具體實現為
1)轉染用 STAT3 的 3，UTRU STAT3 的 3，UTRl 突變體，STAT3 的 3，UTR2、STAT3 的 3，UTR2 突變體禾口 STAT3 的 3，UTR1+2、STAT3 的 3，UTR1+2 的突變體分別與 pcDNA3. 1-pr i-miR17-5p(miR-17-5p)、pcDNA3. l-pri_miR-20a 或者對照結構物(miRctr)共轉腎(人胚 腎)293T細胞。另外構建一組由miR-17-5p和miR-20a抑制劑分別在0. InMUOnM和IOOnM 濃度下轉染的細胞。
2)制備被動裂解緩沖液IXPLB 將1倍體積的5XPLB (Passive LysisBuffer)加 到4倍體積的蒸餾水中，混合均勻，在4°C儲存1個月。
3)制備 LAR II 用 Luciferase Assay Buffer II (目錄號 E1980 105ml)溶解凍 干粉 Luciferase Assay Substrate，_20°C存儲 1 個月。
4)制備 Stop & Glo 試劑加 0. 2ml 的 50 X Stop & Glo 酶到 IOml 的 Stop & Glo 緩沖液中，制成IXMop & Glo試劑。
5)按照說明書將細胞與表達質粒、海腎熒光素酶報告質粒和對照質粒(!Iomega) 用脂質體2000(InvitrOgen公司)進行共轉染。
6)細胞裂解
(1)除去培養細胞中的培養基；
(2)用IXPBS清洗培養細胞，去掉清洗液；
(3)按48孔65ul將1 XPLB加入到培養孔中。
7)被動裂解
在室溫輕緩晃動培養板15分鐘，把裂解液轉移到檢測試管中。
8)轉染后M小時測定海腎和螢火蟲熒光素酶的活動
設置自動進樣器1和2分別分裝IOOul的LARII和Mop&Glo試劑。測量時，使用 1-2秒延遲和5-10秒讀數，在螢光發光儀上(Luminometer)
(1)加入 20ulPLB 裂解液
(2)加入 lOOulLARII
(3)檢測螢火蟲螢光素酶
(4)加入 100uBtop&Glo 試劑
(5)檢測海腎螢光素酶的活性
(6)其它孔如此循環操作。
如圖IB所示，通過熒光素酶活性的比較可以看出，miR-17_5p和miR-20a都能夠 直接的與STAT3 3，UTR的位置156-162 (Bi)和位置403-409 (B2)相互作用進而抑制報告 基因的表達。而STAT的3，UTR種子序列的突變體解除了 miR-17-5p和miR-20a的抑制活性。
如圖IC 所示，顯示了轉染了 STAT3 3，UTR1+2 和 pcDNA3. l-pri-miR17-5p 或者 pcDNA3. l-pri-miR-20a以及濃度上升的miR-17_5p抑制劑(Cl)或者miR_20a抑制劑(C2) 的四31~細胞的熒光素酶活性，轉染了抑制劑陰性對照的細胞作為對照組(Ctr.)。我們可以 看出miR-17-5p的抑制劑和miR-20a的抑制劑也能分別明顯的阻塞miR-17_5p和miR_20a 對熒光素酶活性的負調控。
實施例3
STAT3 的表達被 miR-17_5p 和 miR_20a 調控
用空白iT熒光寡核苷酸轉染單核白細胞/巨噬細胞系RA\^64.7。轉染后M小時 用熒光顯微鏡觀察結果如圖2A所示。
使用Western印跡分析的方法和定時定量PCR的方法觀察miR-17_5p和miR_20a 對STAT表達水平的影響。
(1)在室溫下封閉液中與抗鼠STAT3和抗鼠p47phaX分別反應一個小時，通過用 過氧化物酶偶聯的二抗(試劑盒)和增強化學發光劑(Amersham公司)對這種蛋白質抗體 復合物進行檢測，其中抗鼠STAT3和抗鼠p47phax從SantaCruz Biotechnology公司獲得。 具體實現為
1)轉染按照說明書的步驟，通過核轉染的方法，用miR-17-5pmimicS、miR-20a7mimics,STAT3 siRNA或者由miRNA mimics、miRNA抑制劑和siRNA陰性對照寡核苷酸混合 組成的陰性對照(Ctr.)分別轉染7細胞，共轉48小時后進行Western蛋白印跡分 析以檢測STAT3，gp91和P47在各種共轉條件下mRNA和蛋白表達。
2)蛋白樣品的制備
1>倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液；
2>每瓶細胞加:3ml4°C預冷的PBS，平放輕輕搖動1分鐘洗滌細胞，然后棄去洗液， 重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液，然后把培養瓶置于冰上；
3>按Iml裂解液加IOyL苯甲基磺酰氟(PMSF) (IOOmM)，搖勻置于冰上；
4>每瓶細胞加400 μ L含PMSF的裂解液，于冰上裂解30分鐘，為使細胞裂解充分 培養瓶要經常來回搖動；
5>裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側，然后用加樣器將細胞碎片 和裂解液移至1. 5ml離心管中；
6>4°C 12000rpm 離心 5 分鐘；
7>將離心后的上清分裝轉移到0. 5ml的離心管中放平_20°C保存。
3)電泳
DSDS-PAGE 凝膠配制
SDS-PAGE凝膠使用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒進行配置；
2>樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，于沸水浴中加 熱4分鐘，以充分變性蛋白；
3>上樣與電泳
冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE凝膠加樣孔內即可。為了便于觀 察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預染蛋白質分子量標準，70V電壓 至分離膠與濃縮膠界面，后120V電壓至底。
4)轉膜
1>取一塊PAGE膠，浸泡于電轉緩沖液中，同時把兩張同樣大小的濾紙和兩張海綿 也浸泡于緩沖液中；
2>剪一塊同樣大小的PVDF膜，做如下處理首先浸于100%甲醇溶液10秒，然后 浸于去離子水中3分鐘，最后浸于轉移緩沖液中3分鐘；
3>電轉三明治順序如下正極(白色)海綿
濾紙
PVDF 膜
蛋白膠
濾紙
海綿
負極(黑色)。
5)將三明治夾子放入預裝有電轉緩沖液的電泳槽中，加蓋，接通電源恒壓200V， 120分鐘；
6)將完成后的PVDF膜用去離子水沖洗，放入5%脫脂奶粉中，室溫60分鐘；
7)分別加入一抗(抗鼠STAT3和抗鼠p47phax)，室溫一小時，用TBST洗膜3次， 每次5分鐘；
8)加入酶標二抗(試劑盒)，室溫一小時，用TBST洗膜3次，每次5分鐘；
9)ECL顯色A液和B液按1 1混合加到膜上，暗室壓片，顯影液1分鐘，定影液 1分鐘。
(2) RNA 分離和定時定量 PCR(qRT-PCR)
對于基因和miRNA前體，qRT_PCR使用BIO-RAD熒光定量PCR設備，設計特異性的 引物。對于成熟的miR-17-5p和miR-20a，qRT-PCR使用應用生物系統公司的7900的一羥 色胺的序列檢測系統的標準熒光定量PCR試劑盒。擴增U6的小RNA(用于成熟miRNA的， 應用生物系統公司)和GAPDH mRNA (用于基因和miRNA前體，應用生物系統公司)作為每 一個實驗樣品的內源性對照。所有的反應都平行進行三組。因為折疊產生的變化按照制造 商的說明(應用生物系統公司)采用-Δ ACt的方法進行計算。
結果如圖2B1所示，miR-17-5p和miR_20a均能影響gp91，p47and STAT3的轉錄 和表達。miR-17-5p和miR-20a降低gp91和p47的轉錄但是對STAT3的轉錄影響不大。然 而與此同時,如圖2B2所示，miR-17-5p和miR_20a降低了 STAT3 and p47的表達水平。
在RAW264. 7中，STAT3，gp91 and p47的轉錄和表達的相關水平通過用不用濃度的 miR-17-5p或miR-20a mimic轉染進行檢測。圖2C1. 1和Cl. 2顯示了在轉染了 miR-17_5p mimics或miR-20a mimics的7中成熟的miR-17_5p和miR_20a各自的表達水平。圖 2 的 C2. 1 和 C2. 2，C3. 1 和 C3. 2 以及 C4. 1 和 C4. 2 則分別顯示了轉錄了 miR-17_5p mimics 或 miR-20a mimics 的 RAW264. 7 中 STAT3, gp91 和 p47 的轉錄水平。圖 2 的 C5. 1 和 C5. 2 則顯示了轉染了 miR-17-5p mimics 或miR_20a mimics 的7 中 STAT3 的蛋白水平。 由定時定量PCR的結果我們可以發現隨著miR-17-5p和miR-20a表達水平的升高，對于轉 錄了 miR-17-5p mimics 或 miR_20a mimics 的 7，細胞內的 STAT3 轉錄水平并無明 顯的變化，gp91和p47的轉錄水平均逐漸下調；而由Western Blot的結果我們可以發現隨 著轉錄的miR-17-5p和miR-20a濃度的升高，STAT3的蛋白水平明顯下調。
實施例4
miR-17-5p和miR_20a對于MDSCs的潛在抑制作用的體外實驗
(1)轉染
用miR-17-5p mimics,miR-20a mimics, STAT3 siRNA或混合陰性對照(混合miRNA mimics陰性對照寡核苷酸和siRNA陰性對照寡核苷酸)轉染7細胞。為了調查 腫瘤相關的Gr-Γ⑶Ilb+MDSC上在抗原特異性反應中的抑制作用，用miR-17_5p mimics和 miR-20a mimics, miR-17_5p抑制劑和miR_20a抑制劑，STAT3 siRNA或者它們的陰性對照 (miRNA mimics對照，抑制劑對照和siRNA對照的混合物)轉染MDSCs (除非特殊說明每孔 5X IO5) ,Grl+CDlIb+MDSCs是從CD6腫瘤鼠的脾分離獲得的。VLP(25 μ g/ml)刺激下，將轉 染的MDSCs加入培養的脾的⑶4或⑶8 T細胞(1X106)。用miRNA、miRNA抑制劑或s iRNA 轉染MDSCs，用人類乳頭瘤病毒16的病毒樣粒子(VLPs)免疫鼠脾內的單獨的CD4和CD8T 細胞，兩天后收取上層清液。VLPs分別的作為抑制因子、應答因子和刺激因子，所有的陰性 對照都不能影響STAT3的表達。使用ELISA檢測上層清液中的IFN- y。VLPs特異性的⑶4 或CD8T細胞是與實施例1步驟O)的方法相同，使用CD4和CD8的陽性選擇磁珠和LS柱子(Mitenyi Biotech)篩選獲得的。
(2)酶聯免疫吸附實驗(ELISA)
ELISA夾心法酶聯免疫試劑盒(Pierce Endogen)用于IFN-γ的定量檢測。使用 SpectraMax190ELISA檢測儀測定450nm時每個樣品(上述步驟(1)中獲取的上層清液)的 吸光度，細胞因子的水平通過標準曲線的三次滴定進行量化，單位為pg/ml。
(3) ROS 和 H2A 檢測
按照說明書，使用氧化敏感染料DCFDA(分子探針/Invitrogen)測定7 或 MDSC 產生的 ROS (活性氧)。單個的 CDllb+Gr-I+MDSCs 在 2. 5 μ MDCFDA 和 30ng/ml PMA(Sigma-Aldrich公司購買)中處理30分鐘，然后使用流式細胞分析進行分析；在冰 上，PBS收集細胞，使用以下的抗體(均從BD生物公司購買)異硫氰酸熒光素、聚乙烯和 與抗原呈遞細胞結合的抗 CD4 (L3T4)、抗 CD8 α (Ly-2)、抗 CD 19 (1D8)、抗 CDllb (Ml/70)、 抗Gr-l(RB6-8(^)、抗Ly6G(lA^和抗Ly6C(AL21)抗體。清洗細胞兩次并在含有4% 多聚甲醛和1 % FCS(胎牛血清)的PBS溶液中再懸浮，在進行流氏細胞分析(FAkan， BectonDickson)前將懸液在4°C條件下保存，每組分析過程都用同型的單克隆抗體對照作 為負對照。
H2O2的檢測使用過氧化氫檢測試劑盒(Invitrogen)，將IX IO4個細胞懸浮于PBS， 加入PMA(30ng/ml) 30分鐘后，使用熒光分光光度計(Bio-Rad)測量37°C、560nm的吸光度。 吸光度的結果使用連續稀釋20mM H2O2所做的標準曲線進行標準化。
如圖3々所示，1^1 -17-5 和1^1 -2(^均能降低在1^^^64.7細胞中1 05仏1)的表達 和H202 (A2)的產生；如圖;3B所示，miR-17-5p和miR-20a同樣能夠降低在腫瘤相關的MDSCs 中ROS的表達和H2O2的產生，其中圖3的Bi. 1和B2. LBL 2和B2. 2以及Bi. 3和B2. 3分別顯 不了轉染了 miR-17-5p mimics (miR-17_5p. mi),miR-20a mimics (miR-20a. mi)，miR-17_5p 抑制劑(miR-17-5p. inh)和 miR_20a 抑制劑(miR-20a. inh)和陰性對照(Ctr.)的 MDSCs 中成熟miR-17-5p和miR-20a的表達水平、ROS的表達水平和H2A的產生，Geo代表幾何平 均數；如圖3C所示，miR-17-5p和miR-20a降低了腫瘤相關MDSCs的抑制潛能。miR-17_5p 和miR-20a阻塞了腫瘤相關MDSCs對于VUs特異性的CD4(C1，C2)和CD8T淋巴細胞(C3， C4)的影響效果。然而，miR17-5p和miR-20a抑制劑促進了腫瘤相關MDSCs對于VLPs特異 性的CD4(C1，C3)和CD8T淋巴細胞(C2，C4)的抑制效果。抑制率(Inhibition% )=在共 培養的T細胞中上清液所含有的IFN- γ的濃度加上MDSCs的抗原除以在共培養的T細胞 中上清液所含有的IFN- γ的濃度加上沒有MDSCs的抗原，即
在共培養的τ細胞中上清液所含有的IFN- Y的濃度+MDSCs的抗原抑制率=_在共培養的T細胞中上清液所含有的IFN- γ的濃度+沒有MDSCs的抗原
統計分析時采用了檢定的方法，95%的置信限度被認為是有意義的，*(單個星 號)P < 0. 05，**(雙星號)P < 0. 01。
實施例5
miR-17-5p和miR_20a對于MDSCs的潛在抑制作用的體內實驗
在MDSC抑制的體內實驗中，在接種了 CT46腫瘤細胞之后的第一天到第七天，將miR-17-5p mimics 和 miR_20a mimics、miR-17_5p 抑制劑和 miR_20a 抑制劑、STAT3 siRNA 或STAT3的陰性對照轉染的MDSCs注射進入鼠的腫瘤內。對于miRNA mimics、miRNA抑 制劑、siRNA或者siRNA陰性對照的轉染，在IOOnM的指示寡核苷酸濃度下，按照生產協議 (Amaxa，Germany)，運用核轉染(nucleofection)的方法對BALB/C鼠的BMC進行轉染，即殺 死小鼠取骨髓細胞，用1640培養基將BMC吹下來，加PBS離心；用PBS稀釋至1*107/100 μ 1 個細胞，加質粒5 μ g\100 μ 1，混勻后放入電轉儀；將電轉儀調至Stemcell程序進行電轉， 每次加樣100 μ 1，電轉后打入老鼠體內即可。5周齡小鼠首先皮下注射5*105CT46細胞，一 周左右后至腫瘤長至米粒般大小，每只鼠分別注射2X IO6個預先處理好的BMCs，在7、11、 15、19、23、27天后殺死小鼠。測量腫瘤的大小、重量、體積，腫瘤的測量使用卡尺，每組6只 鼠去平均值，誤差線代表平均值士SD。統計分析時采用了檢定的方法，95%的置信限度被認 為是有意義的，單個星號P < 0. 05，雙星號P < 0. 01。
圖4A顯示了在7、11、15、19、23、27天殺死小鼠，用對照組(天然鼠)與分別移植了 轉染了 miR-17-5p mimics,miR-20a mimics 或者 STAT3 siRNA(STAT3siRNA)的 MDSCs 的鼠 體內腫瘤的大小(Al)、重量(A2)、體積(A3)進行比較。與移植了用對照轉染的MDSCs(Ctr.) 接種過疫苗的CT-沈腫瘤鼠相比，在移植了轉染了 miR-17-5p mimics, miR-20a mimics或 者STAT3 siRNA的MDSCs的鼠體內，腫瘤生長速度減慢。因此miR-17_5p，miR_20a或者 STAT3siRNA能夠減輕MDSCs的抑制潛能。
圖4B顯示了腫瘤的重量(Bi)和在7、11、15、19、23、27天殺死小鼠，移植了用對 照、miR-17-5p 抑制劑(miR-17_5p. inh)、miR_20a 抑制劑(miR_20a. inh)轉染的 MDSCs 的 鼠體內腫瘤的體積(B2)，與移植了用對照轉染的MDSCs(Ctr.)接種過疫苗的CT46腫瘤鼠 相比，在移植了轉染了 miR-17-5p抑制劑(miR-17-5p. inh)，miR_20a抑制劑(miR_20a. inh) 的MDSCs的鼠體內，腫瘤生長加快，因此miR-20a抑制劑和miR-17_5p抑制劑加強MDSCs的 抑制潛能。
實施例6
腫瘤相關因素調節miR-17_5p和mir-20a的表達
(1)流式細胞分析對MDSCs分群
使用研磨法分別從患有CD6結腸癌、Lewis肺癌和1D8卵巢癌的小鼠的脾臟中取 細胞制備單細胞懸液
1)小鼠用C02處死，立即無菌取脾；
2)將脾浸入裝有冷PBS的培養皿中，用鈍頭剪刀剪去白色的結締組織，換入另一 個裝有冷PBS的培養皿中以清洗脾臟；
3)再次換入一個裝有冷PBS的培養皿中；
4)用小的彎頭手術剪剪切脾臟成3mm左右的小塊；
5)用IOml塑料一次性注射器的尾部背面輕輕按壓研磨脾臟小塊，此時會看到很 多脾單細胞進入PBS中；
6)使用Falcon(BD生物公司)過濾獲得單細胞懸液，用冷PBS洗滌2次，每次 1000r/min，離心 10 分鐘；
7)將細胞懸浮于RPMI 1640(含10%熱滅活胎牛血清)中，用臺酚蘭染色計數活 細胞數(在95%上)；11
8)調節細胞濃度為2 X IO6細胞/ml。
從BD生物公司購買異硫氰酸熒光素、聚乙烯和與抗原呈遞細胞結合的抗 CD4(L3T4)、抗 CD8a(Ly-2)、抗 CD19(1D8)、抗 CDllb (Ml/70)、抗 Gr-1 (RB6-8C5)、抗 Ly6G(lA8)和抗Ly6C(AL21)抗體。細胞染色后在含有4%多聚甲醛和FCS (胎牛血清) 的PBS溶液中再懸浮，得到MDSCs。在進行流氏細胞分析(FAkan，Becton Dickson)前將 懸液在4°C條件下保存，每組分析過程都用同型的單克隆抗體對照作為負對照。
如5A1所示，通過流式細胞分析，可以對MDSCs進行分群，包括Pl (⑶llb+Gr-Γ細 胞)及它的兩個亞群P2 (Ly6C+ly6G+細胞)和P3 (ly6G 口 ly6C+細胞)。
(2) qRT-PCR
使用qRT-PCR 的方法檢測腫瘤相關的 MDSCs 中 pri-miR-17_5p，pri_miR-20a， STAT3 和 GAPDH 的表達水平。腫瘤相關的 MDSCs 中 pri-miR-17_5p，pri_miR-20a，STAT3 和GAPDH的表達水平如圖5A2所示；從CT26腫瘤鼠(CT26)、Lewis腫瘤鼠(Lewis)和 1D8腫瘤鼠(1D8)的脾獲得的MDSCs中，成熟miR-17_5p，成熟miR_20a和STAT3在 Grl+CDlIb+MDSCs (A3) ,LyeG+LyeC+MDSCs (A4)和 LyeGl^eC+MDSCs (A5)的表達水平如圖 5A3、 A4、A5所示，從CT26結腸癌鼠、Lewis肺癌鼠和1D8卵巢癌鼠體內的MDSCs內，miR-17_5p 和miR-20a的表達水平降低。
將BMCs細胞和CD6腫瘤細胞在一個培養瓶內培養。使用qRT-PCR的方法檢測成 熟miR-17-5p(圖Bi)和成熟miR_20a(圖B2)和STAT3 mRNA(圖B3)的表達水平，圖5B1 顯示的是成熟miR-17-5p的表達水平，圖5B2顯示的是成熟miR_20a的表達水平，圖5B3 顯示的是STAT3 mRNA的表達水平。由結果我們可以得出結論腫瘤相關因子調節骨髓細胞 (BMCs)中 miR-17-5p、miR-20a 和 STAT3 的轉錄。
(3) Western蛋白印記分析
將BMCs細胞和CD6腫瘤細胞在一個培養瓶內培養，使用western blot檢測 STAT3的蛋白水平，方法如前所述。如圖5C所示，腫瘤相關因子調節STAT3和p47在BMCs 中的水平。
可見，miR-17-5p和miR-20a為具有減緩髓系抑制細胞(MDSCs)抑制作用等功能 的新分子，在免疫應答中發揮重要作用。通過本發明研究發現miR-17-5p和miR-20a功能 之一就是調節STAT3表達量，而STAT3與腫瘤等疾病有著很密切的聯系。
在腫瘤患者體內發現MDSCs的大量積聚，參與腫瘤細胞的免疫編輯，包括免疫清 除，免疫對抗，免疫逃逸三個過程，因此抑制MDSCs的表達則很可能成為有效治療腫瘤的手 段，本發明中miR-17-5p和miR-20a則通過調節STAT3表達來降低MDSCs的積聚，因此本發 明具有積極的效果和意義。
STAT3 表達量可以被 miR-17-5p 和 miR_20a 調節，通過 miR-17_5p 和 miR_20a 結合 STAT3 3，UTR結合位點。轉染miR-17-5p和miR_20a后，由STAT3調節的ROS和H2O2的表 達量顯著下降。miR-17-5p和miR-20a轉染MDSCs后，降低了抗原特異性⑶4和⑶8陽性T 淋巴細胞的免疫抑制。重要的是，miR-17-5p和miR-20a降低了 MDSCs的抑制性，在小鼠腫 瘤MDSCs中轉染了 miR-17-5p和miR_20a之后腫瘤的生長速度要比未轉染的慢，然而作為 對照組，在小鼠腫瘤MDSCs中轉染miR-17-5p和miR-20a的抑制物之后腫瘤的生長速度明 顯加快。在腫瘤鼠中miR-17-5p和miR-20a的表達水平比未患病小鼠低，腫瘤相關因子下調miR-17-5p和miR_20a的表達量。可以預見，在腫瘤患者體內，miR-17_5p和miR_20a發 揮著打破腫瘤免疫耐受的重要作用，從而揭示了 miR-17-5p和miR-20a可以作為免疫治療 腫瘤的靶向分子。
上述參照具體實施方式
對該微小RNA的新用途進行的詳細描述，是說明性的而不 是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發明總體構思下的 變化和修改，應屬本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.miR-17"5p在制備通過調節免疫細胞的表達抑制髓系來源抑制細胞積聚以抑制腫瘤 生長的靶向藥物中的用途。
2.根據權利要求1所述的miR-17-5p的新用途，其特征在于所述miR-17_5p在制備 通過調節免疫細胞抑制結腸癌、肺癌或卵巢癌生長的靶向藥物中的用途。
3.miR-20a在制備通過調節免疫細胞的表達抑制髓系來源抑制細胞積聚以抑制腫瘤生 長的靶向藥物中的用途。
4.根據權利要求3所述的miR-20a的新用途，其特征在于優選的，所述miR_20a在制 備通過調節免疫細胞抑制結腸癌、肺癌或卵巢癌生長的靶向藥物中的用途。
全文摘要
miR-17-5p在制備通過調節免疫細胞的表達抑制髓系來源抑制細胞積聚以抑制腫瘤生長的靶向藥物中的用途，即制備以miR-17-5p為靶點的藥物來抑制腫瘤生長；miR-20a在制備通過調節免疫細胞的表達抑制髓系來源抑制細胞積聚以抑制腫瘤生長的靶向藥物中的用途，即制備以miR-20a為靶點的藥物來抑制腫瘤生長，對腫瘤臨床免疫治療有著潛在的巨大應用價值，并且為進一步研究miR-17-5p和miR-20a的生物學功能奠定了基礎。
文檔編號A61P35/00GK102038703SQ20101055165
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月19日 優先權日2010年9月27日
發明者劉喬飛, 張園, 張苗苗, 楊榮存, 王萌萌, 陳穎瑩 申請人:南開大學