專利名稱：基因重組蛛絲蛋白－高聚物組織工程多孔支架材料的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學材料領域，具體說涉及一種組織工程支架材料，尤其是重組蛛絲蛋白-高聚物多孔支架材料。
背景技術：
組織和器官的衰竭、損傷是最主要的臨床醫學問題，而目前的治療方法主要是器官移植、外科修復、人工取代物，這些方法雖然能起到一定的作用，但它們都存在這樣或那樣的不足，如器官移植是以犧牲健康組織為代價的“以傷治傷”的方法；現有人工取代物存在生物相容性的問題。直到20世紀80年代，美國學者提出了組織工程再生醫學，它是利用生命科學和工程科學的原理和方法，研究和開發用于替代組織或器官的一部分或全部功能的取代物(Langer R，Vacanti J P.Tissue engineering.Science，1993，260920)。組織工程的發展，提高了組織工程組織和器官的衰竭、損傷的治療水平，改善了患者的生活質量，有效地降低醫療成本.
組織工程學研究的主要科學問題之一是可供細胞進行生命活動的支架材料以及細胞與支架材料的相互作用，核心是建立由細胞和生物材料構成的三維空間復合體。理想的生物材料在組織工程中起關鍵作用，并成為組織工程研究的主流。
在生物材料的研究經歷了第一代惰性材料，第二代具有活性或具有降解性質之后，已發展到兼有可降解和生物活性的第三代生物材料(L.L.Hench etal.Science，2002，2951014)。
目前，組織工程中天然生物材料的主要是膠原蛋白，人工合成的替代物主要是聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)和聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物(PLGA)。要獲取理想的天然支架材料有一定困難，而且也存在一些問題，如膠原蛋白的抗原性強、力學強度不夠，在處理過程中膠原蛋白容易變性等；人工合成的替代物雖然也具有可生物降解特點，如美國FDA認可的體內植入材料，已被制成可吸收的縫線、夾板、螺釘及敷料等，但這些材料在生物相容性、理化性能、降解速率的控制及緩釋性等方面還需改進。因此，目前研究的著重點更多的是尋找可人工合成、生物相容性好、可降解的支架材料。
作為組織工程的第三代生物新材料開發，蜘蛛絲蛋白具有得天獨厚的條件。蜘蛛絲膜具有很好的透明性、生物可降解性和水-空氣界面的通透性。與膠原蛋白和彈性蛋白相似，蜘蛛絲蛋白具自裝配性質，通過二級結構調節以提供機械支撐；與聚酯比較，絲的柔韌性和彈性使其經得起重壓和疲勞。絲蛋白生物相容性好，與膠原起同樣的細胞粘附、擴展、分化和生長的作用。絲基質還有機械誘導作用，通過調整絲基質的硬度，提供控制基質的最終機械特性來模仿天然機體組織的機械特性和支持宿主組織內生長。因此它在醫學應用、外科縫合線、生物材料襯膜和支架、細胞生長支撐支架和控制釋放基質上表現出極大的應用潛力(Winkler S，Kaplan DL.Molecular biology of spidersilk.Reviews in Molecular Biotechnology，2000，7485)。
福建師范大學李敏等在福建省自然科學基金重大科技項目(2001F 006)、教育部重點項目(02072)和國家自然科學基金項目(30370414)的支持下分別于2002年(李敏，章文賢，黃建坤等.蜘蛛拖絲蛋白基因的構建及在大腸桿菌中的表達，生物工程學報，2002，18(3)331)和2004年(李敏，黃建坤，涂桂云等，RGD-蜘蛛拖絲蛋白基因的構建、表達與純化，生物醫學工程學雜志，2004，21(6)1006)先后公開了該研究小組根據蜘蛛絲的結構和功能特性，應用基因工程為核心的現代生物技術，利用原核生物表達體系，結合鳥槍法與物理圖譜法對蜘蛛拖絲蛋白全基因進行克隆、測序與表達，構建了多種特殊序列的蛛絲蛋白基因，建立了可生產化的發酵罐高密度發酵工藝條件等技術，使得公眾能以簡便易行、低成本和有效的分離純化方法規模化制備重組蛛絲蛋白，為大量應用蜘蛛絲蛋白作為組織工程新材料奠定了研究開發基礎。

發明內容
為了解決現有組織工程材料在生物相容性、生物降解性和機械性能的不足，本發明的目的就是根據蜘蛛絲獨特的機械特性和生物相容性以及其本質是蛋白質的結構特點，利用已經公開的可規模化制備的重組蜘蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物為主要原料制備生物相容性好、可降解的組織工程支架材料。該支架材料不僅能被降解成人體可吸收氨基酸，具有很好的生物相容性和較好的機械性能，且可批量生產。
為實現本發明的目的所采用的技術方案是以基因重組蜘蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物為主要原料制備生物相容性好、可降解的支架材料。其中基因重組蜘蛛絲蛋白所占的質量百分比為55-95％，生物可降解的高聚物所占的質量百分比為45-5％。
本發明中生物可降解的高聚物是指聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚氰代丙烯酸酯、聚己內酯、聚對二氧雜環己酮及其共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚膦腈、聚羥基丁酸、其他線性脂肪族聚酯、聚氨基酸、甲殼素、殼聚糖、纖維素、聚乙烯醇、聚氧乙烯中一種或他們的組合。
本發明可以用致孔法來制備多孔支架材料，具體工藝1.配制支架制備液取基因重組蛛絲蛋白粉溶解于80-98％甲酸得到蛋白溶液，再加入高聚物，混勻即得到含基因重組蛛絲蛋白和高聚物的支架制備液。其中基因重組蛛絲蛋白所占的質量百分比為55-95％，生物可降解的高聚物所占的質量百分比為45-5％。
2.添加致孔劑加入致孔劑如氯化鈉，混勻。
3.倒模、加熱將添加有致孔劑的支架制備液倒入模具中，置于55-90℃烘箱10-60分鐘形成支架。
4.變性將支架浸泡在變性劑溶液(如乙醇)中變性10-15小時后取出，置于蒸餾水浸泡8-12小時。
5.冷凍干燥變性后的支架于-70℃冷凍干燥1-5小時即可得多孔支架材料。
本發明的有益效果是1.采用基因重組蛛絲蛋白制得的多孔支架材料，由于它的本質是天然蛋白質分子，使它具有了很好的生物相容性和可降解性。
2.加入生物可降解的高聚物不僅進一步提高多孔支架機械性能、調控泡沫支架材料的可降解特性，而且也有利于降低泡沫支架的成本。
3.支架的加工工藝簡單，成本低，對于工業化大批量生產也適合。
附1、圖2是泡沫支架材料外觀圖。
圖3、圖4是泡沫支架材料剖面掃描電鏡圖。
下面根據實施例對本發明做進一步說明。
具體實施例方式
實施例11.配制支架制備液取2.25g基因重組蛛絲蛋白粉溶解于7.5ml 98％甲酸得到30％(w/v)蛋白溶液，再加入0.45g聚乙烯醇，混勻，即得到含基因重組蛛絲蛋白和聚乙烯醇的支架制備液。
2.添加致孔劑加入1.5g致孔劑氯化鈉，混勻。
3.倒模、加熱將添加有致孔劑的支架制備液倒入圓柱形模具(R＝2cm)中，放入70℃烘箱30分鐘。
4.變性、蒸餾水浸泡將支架浸泡在乙醇中變性15小時，蒸餾水浸泡10小時。
5.冷凍干燥變性后的支架，-70℃冷凍2小時即可得多孔支架材料。
實施例21.配制支架制備液取2.5g基因重組蛛絲蛋白粉溶解于10ml98％甲酸得到25％(w/v)蛋白溶液，加入1.25g殼聚糖，混勻，即得到含基因重組蛛絲蛋白和殼聚糖的支架制備液。
2.添加致孔劑加入2.0g致孔劑氯化鈉，混勻。
3.倒模、加熱將添加有致孔劑的支架制備液倒入長方形模具(4cm×3cm×3cm)中，放入60℃烘箱20分鐘。
4.變性、蒸餾水浸泡將支架浸泡在乙醇中變性10小時，蒸餾水浸泡8小時。
5.冷凍干燥變性后的支架，-70℃冷凍4小時即可得多孔支架材料。
實施例31.配制支架制備液取2g基因重組蛛絲蛋白粉溶解于6ml98％甲酸得到33％(w/v)蛋白溶液，再加入1.0g殼聚糖和0.25g聚乙烯醇，混勻，即得到含基因重組蛛絲蛋白、殼聚糖和聚乙烯醇的支架制備液。
2.添加致孔劑加入1.0g致孔劑氯化鈉，混勻。
3.倒模、加熱將添加有致孔劑的支架制備液倒入長方形模具(4cm×3cm×3cm)中，放入65℃烘箱30分鐘。
4.變性、蒸餾水浸泡將支架浸泡在乙醇中變性13小時，蒸餾水浸泡12小時。
5.冷凍干燥變性后的支架，-70℃冷凍3小時即可得多孔支架材料。
權利要求
1.本發明涉及一種組織工程多孔支架材料，其特征在于以基因重組蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物共混得到多孔支架材料。
2.根據權利要求1所述，制備多孔支架材料的蛋白質是基因重組蛛絲蛋白。
3.根據權利要求1所述，制備多孔支架材料的高聚物是生物可降解的高聚物，包括聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚氰代丙烯酸酯、聚己內酯、聚對二氧雜環己酮及其共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚膦腈、聚羥基丁酸、其他線性脂肪族聚酯、聚氨基酸、甲殼素、殼聚糖、纖維素、聚乙烯醇、聚氧乙烯等。
4.根據權利要求1、3所述，制備多孔支架材料的高聚物可以是其中的一種或他們的組合。
5.根據權利要求1所述，基因重組蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物的配比(質量比)為基因重組蛛絲蛋白所占的質量百分比為55-95％，生物可降解的高聚物所占的質量百分比為45-5％。
全文摘要
本發明屬于生物醫學材料科學工程領域，涉及一種組織工程支架材料，尤其是多孔支架材料。本發明以基因重組蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物共混得到組織工程支架材料，基因重組蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物的配比(質量比)為基因重組蛛絲蛋白所占的質量百分比為55－95％，生物可降解的高聚物所占的質量百分比為45－5％。本發明得到的多孔支架材料具有很好的生物相容性、可降解性和較優越的機械特性，不僅加工工藝簡單、成本低，而且也適合工業化批量生產。
文檔編號A61L27/56GK1751748SQ200510076750
公開日2006年3月29日 申請日期2005年6月14日 優先權日2005年6月14日
發明者李敏, 陳登龍, 涂桂云, 黃曦, 周志華 申請人:福建師范大學