專利名稱：一種新型促肝細胞生長因子、制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型促肝細胞生長因子、制備方法及其用途。本發明還涉及表達該新型促肝細胞生長因子的基因工程菌。
背景技術：
重組蛋白可通過直接表達或以融合蛋白的形式進行表達。在第一種方法中，采用重組技術生產的人促肝細胞生長因子以不溶的包涵體形式表達，包涵體經過變性、復性后再進行純化。
在第二種方法中，可溶表達的重組人促肝細胞生長因子是以融合蛋白的形式表達的。例如參考文獻①.Francavilla Antonio T等；Mammalian augmenter of liver regeneratingand variant thereof； EP668291，1995。
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張誼俊等從新生動物如乳豬等肝臟提取的促肝細胞生長因子對重癥肝炎、肝硬化、慢性活動性肝炎等有很好的治療效果。有些醫院曾采用人胎肝治療重癥肝炎也取得滿意效果，但受來源限制，不能滿足臨床需要?；蚬こ碳夹g為人促肝細胞生長因子的臨床應用帶來了希望。國內重組人促肝細胞生長因子的研制在國際上也處于領先地位。國外對重組促肝細胞生長因子的研究重點之一是其巰基氧化酶活性的研究；T.Lisowsky等人采用含有6個組氨酸的融合蛋白的形式表達了人促肝細胞生長因子，此融合蛋白含有黃色色素，T.Lisowsky同時發現該黃色色素為FAD，是巰基氧化酶活性不可缺少的輔基。
目前國內外文獻中報導的以非融合蛋白形式表達的重組人促肝細胞生長因子(recombinant human augmenter liver regeneration，rhALR)都是以大腸桿菌為宿主，表達產物以包涵體形式存在。本發明人分別構建了以包涵體和可溶形式表達目的蛋白的基因工程大腸桿菌。并發現，以可溶形式表達的基因重組hALR，經分離純化后，含有黃色色素，在高濃度變性劑存在下，通過加熱或調節pH，可去除黃色色素。經檢測證實該色素源自FAD，因此，以可溶形式表達的基因重組人促肝細胞生長因子是一種新型含有FAD的促肝細胞生長因子(rFALR)。與不含FAD的以包涵體形式表達的促肝細胞生長因子(rhALR)相比，rFALR對CCl4損傷小鼠肝功能恢復的促進作用強于不含FAD的rhALR。由于目的蛋白以可溶形式表達，無需進行包涵體變性及蛋白復性，大大簡化了蛋白純化工藝，使收率得到提高，并降低了制造成本，為大規模生產打下良好基礎。

發明內容
本發明的目的是提供一種新型的含有FAD的促肝細胞生長因子(rFALR)、其制備方法及用途，其產物以可溶形式表達，不形成包涵體，因此簡化了制備工藝，同時提高了收率，大大降低了成本。并且具有更高的生物活性。有利于工業化生產。
根據本發明，提供了1、一種新型重組人促肝細胞生長因子(rFALR)，其特征在于含有如序列表中序列2所示的氨基酸序列和FAD輔基。
2、一種能表達以上項1的重組人促肝細胞生長因子的基因工程菌，其特征在于同時含有重組人促肝細胞生長因子和細菌素釋放蛋白的表達載體。
3、構建能表達以上項1的重組人促肝細胞生長因子的基因工程菌的方法，包括含有目的基因的載體的構建和轉化。
4、構建能表達以上項1的重組人促肝細胞生長因子的基因工程菌的方法，進一步包括引入可表達細菌素釋放蛋白(bacteriocin release proteinBRP)的質粒。
5、以上項1的新型重組人促肝細胞生長因子在制備治療肝病的藥物中的用途。
6、以上項5的用途，其中所述肝病為重癥肝炎、肝硬化或慢性活動性肝炎。
7、制備以上項1的新型重組人促肝細胞生長因子的方法，包括以下步驟A、構建能同時含有重組人促肝細胞生長因子和細菌素釋放蛋白的表達載體的基因工程菌；B、培養該基因工程菌；C、純化目標蛋白。
本發明采用PCR的方法從cDNA文庫中獲得人ALR基因，構建能表達ALR的工程菌。并通過引入可表達細菌素釋放蛋白(bacteriocin releaseprotein BRP)的質粒pJL3，實現ALR在大腸桿菌的可溶性表達。獲得一種新型的含有FAD的促肝細胞生長因子(rFALR)。細菌素是細菌中產生并釋放的一種蛋白，大腸桿菌中細菌素的釋放依賴于BRP基因的表達，將含BRP基因的pJL3質粒轉入大腸桿菌后，在誘導條件下，BRP基因表達，可激活外膜上的磷脂酶A，增加大腸桿菌壁的通透性，從而使外源蛋白能夠分泌到培養基中。
包涵體經過裂解、復性，再對復性液進行層析純化，獲得目的蛋白；rFALR以可溶形式表達，可直接進行層析純化，獲得目的蛋白(目的蛋白經分析，具有如序列表中序列2所示的氨基酸序列)。
將rFALR與變性劑混合，通過調節溶液pH或溫度，使FAD與ALR解離。再用凝膠過濾的方法將蛋白與FAD分離后用全波長掃描、LC-MS等方法來研究色素性質。
本發明對目的蛋白進行了體內活性研究。采用CCl4損傷小鼠模型，研究rhALR及rFALR的降轉氨酶活性、和刺激肝細胞內DNA合成的活性。因此可用于治療各種肝病尤其對于重癥肝炎、肝硬化、慢性活動性肝炎等肝損傷性疾病。


圖1是全波長掃描圖，其中1為FAD標準品，2、3和4為rFLAR在不同條件下分離的色素。
圖2是酶活性結果圖。
圖3是菌1破壁后包涵體和上清液電泳分析圖，其中1包涵體，2裂解上清液。
圖4是菌1表達及純化結果圖，其中1為菌體，2為純化后蛋白(非還原電泳)，3為分子量標準97000、66000、45000、30000、20100、14400。
圖5是菌2表達及純化結果電泳圖，其中1為分子量標準(同圖4)，2為純化后蛋白(非還原電泳)；3為菌體。
圖6是是菌1和2表達產物純化后蛋白的電泳圖，其中1、2分別為菌1、菌2表達產物純化后的蛋白(還原電泳)，3為分子量標準(同圖4)。
圖7是rhALR掃描圖(ALRscan)圖8是FAD加入到rhALR的掃描圖(F+ALRscan)圖9是rFALR的掃描圖(FALRscan)實施例方法一(菌1)1.工程菌的構建引物設計forwardprimer5’gacatatgcggacgcagcagaagcgggacac 3’reverseprimer 5’gtctcgagtgcggcctctagtcacaggagccatc 3’采用PCR的方法從人cDNA文庫中獲得ALR基因片段，PCR反應體系模板2μl10xPCR buffer(不含Mg) 5μlMgCl25μlTaq 0.5μlFP 1μlRP 1μldNTP1.5μlddH2O 34μl94℃5分鐘。然后30個循環(94℃ 60秒，67℃ 60秒，72℃ 60秒)，然后72℃ 10分鐘，PCR產物大小約為400bp。
PCR產物與T-VECTOR(PROMEGA)用T4連接酶連接，然后轉化DH5α，挑取白斑，用QIAGEN的MINI質粒提取柱提取質粒并用酶切驗證，找出正確片段插入T-VECTOR的質粒后，將質粒用NDEI/XHOI酶切，瓊脂糖電泳并回收。同時用NDEI/XHOI酶切質粒pET22B，膠純化后回收。
將PCR片段連接到pET-22B，轉化非表達宿主菌中(DH5α)驗證，測序，具有如序列表中序列1所示的核苷酸序列，然后轉化表達宿主菌(BL21-GOLD(DE3))，獲得菌1。
2.發酵將菌1接種于含有氨芐青霉素的LB培養基中，于37℃培養3小時，用IPTG誘導，繼續培養3小時后，離心收集菌體。電泳檢測表達結果如圖3。
3.目的蛋白純化將上述菌體按1∶10(W/V)懸于50mmol/L Tris HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0緩沖液中，超聲破碎，然后于10,000g離心15min，分別收集包涵體沉淀，進行電泳檢測，結果如圖4。結果顯示在包涵體和上清液中都含有大量目的蛋白，只是上清液中雜蛋白較多。
將上清液中的目的蛋白調pH至4.5----6.0，離心，收集沉淀。并將沉淀重新懸浮于pH6.0的緩沖液中。
將上述含有目的蛋白的溶液上陽離子交換層析柱CM Sepharose FastFlow(Amershan Bioscience)純化，平衡液為20mmol/L NaAc pH6.0，上樣后，用平衡液洗去未結合蛋白，再用NaCl連續梯度洗脫，獲得目的蛋白(rFALR)。
包涵體用2mol/L尿素溶液洗滌后，將包涵體過夜溶解于8mol/L尿素、50mmol/L Tris HCl、pH8.0溶液中，再于15,000g離心，回收上清液。
裂解液用DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)柱純化，平衡液為8mol/L尿素、20mmol/L Tris HCl pH 8.0；上樣后用平衡液洗去未結合的蛋白，再用NaCl連續梯度洗脫，收集洗脫峰。
將目的峰按1∶10稀釋于含有0.1mmol/L GSSG、1mmol/L GSH、20mmol/L Tris HCl pH8.0緩沖液中，于4℃過夜。
將上述復性液調pH至5.5，于15,000g離心去除沉淀，用CMSepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)柱純化，平衡液為20mmol/LNaAc pH5.5，上樣后用平衡液洗去未結合的蛋白，再用NaCl連續梯度洗脫，收集洗脫峰。
將目的峰濃縮后用Superdex 75(Amersham Biosciences)柱進行精制，平衡液為20mmol/L NaAc pH5.5。收集目的蛋白(rhALR)。
方法二(菌2)1.工程菌構建在方法一所構建的工程菌基礎上，再引入可表達細菌素釋放蛋白(bacteriocin release protein BRP)的質粒pJL3，在外源條件誘導下，通過BRP基因表達，激活外膜上的磷脂酶A，增加大腸桿菌壁的通透性，從而使外源蛋白能夠分泌到培養基中。實現外源蛋白的可溶性表達。pET22B和pJL3分別為氨芐青霉素抗性和氯霉素抗性；均為IPTG誘導。
2.發酵將菌2接種于含有氨芐青霉素和氯霉素的的LB培養基中，于37℃培養3小時，用IPTG誘導，繼續培養3小時后，離心收集菌體。電泳檢測表達，結果如圖5、圖6。
3.目的蛋白純化收集菌體并懸浮于50mmol/L pH8.0的Tris HCl緩沖液中，超聲或勻漿破碎，于10000rpm離心收集上清液將上清液pH調至4.5----6.0，離心，收集沉淀。并將沉淀重新懸浮于pH6.0的緩沖液中。
將上述含有目的蛋白的溶液上陽離子交換層析柱CM Sepharose FastFlow(Amershan Bioscience)純化，平衡液為20mmol/L NaAc pH6.0，上樣后，用平衡液洗去未結合蛋白，再用NaCl連續梯度洗脫，獲得目的蛋白。
上述目的蛋白經超濾濃縮后，再經過凝膠過濾層析柱Superdex 75(Amersham Biosciences)，收集目的峰，濃縮，可獲得高純度的新型促肝細胞生長因子(rFALR)。
分析1.FAD的確認可溶性表達產物為黃色，用全波長掃描確定新型促肝細胞生長因子含有FAD的特征峰形，結果如圖1。
在8mol/L尿素存在下，于65℃加熱15min(或將pH調至4.0)，再經Superdex 75(Amersham Biosciences)柱分離，可將蛋白和色素分離。分離后的色素經全波長掃描、RP-HPLC和LC-MS分析，結果與FAD標準品一致(圖1)，該蛋白具有如序列表中序列2所示的氨基酸序列。
以上結果說明新型促肝細胞生長因子含有FAD。
另外，將rhALR與FAD混合，掃描，再將混合物經過凝膠過濾進行分離，濃縮目的蛋白后再掃描。結果表明，rhALR不與FAD結合。另在rhALR復性過程中加入FAD，rhALR也不與FAD結合。
將FALR經過上述同樣方法處理，掃描結果表明，FAD與FALR結合。以上結果參見圖7、8、9。
以上事實充分說明，FALR不同于rhALR，FALR與FAD可形成穩定的復合物。而這種結合是通過表達實現的。
2.體內活性檢測方法一降轉氨酶活性研究
42只昆明種雄性小鼠隨機分為6組，分別為生理鹽水組、損傷模型組、rFALR組和rhALR組。每天給藥一次，第三天給藥1小時后，除生理鹽水組以外，其余各組小鼠，分別腹腔注射0.2％的CCl4油溶液(0.2ml/只)，禁食18小時后再給藥1次，2小時后眼眶取血，分離血清。用南京建成生物工程公司生產的試劑盒測定谷丙轉氨酶。
如表1和圖2所示的結果表明，rFALR降低肝損傷小鼠轉氨酶的效果優于rhALR。
表1 降轉氨酶活性

△vs生理鹽水組**vs CCl4模型組方法二刺激肝細胞DNA合成16只昆明種雌性小鼠，皮下注射CCl4原液(0.1ml/只)，6小時后隨機分為4組，每組4只。腹腔注射給藥，對照組為生理鹽水。17小時后，腹腔注射相同劑量的[3H]-TdR(生理鹽水配制-50uCi/ml-0.3ml/只)進行標記，標記2h后斷頸處死小鼠，剖腹取出全部肝組織(重約1g)。提取肝細胞DNA，并進行[3H]-TdR檢測。
結果表明，rFALR具有明顯的促進DNA合成作用，效果優于rhALR。
表2促進DNA合成活性([3H]-TdR摻入法)

3.巰基氧化酶活性研究按照Ellman法，將待測物(rFALR和rhALR)與還原后的溶菌酶在1-2mol/L尿素溶液中混合(pH7.5)，定時取一定量的反應物，加入DTNB至終濃度為10uM，于412nm處測定光吸收。
結果表明，僅rFALR有巰基氧化酶活性。
發明效果1、現有技術第一種方法中的基因重組人促肝細胞生長因子表達產物為包涵體，包涵體經裂解、復性、純化后，所得產物為二聚體。本發明所述的基因重組新型促肝細胞生長因子表達產物以可溶形式存在，為含有FAD的二聚體；并且由于無需經過包涵體的裂解、復性，大大簡化了生產工藝，提高了收率。
2、現有技術第二種方法中的可溶表達的重組人促肝細胞生長因子是以融合蛋白的形式表達的，與天然產物相比，其N端含6個組氨酸或谷胱甘肽S轉移酶等，需對融合蛋白進行相應的酶切才能獲得與天然蛋白氨基酸組成一致的蛋白。而我們采用的單質粒工程菌可同時表達rhALR和rFALR，雙質粒工程菌的表達產物均為可溶性的新型人促肝細胞生長因子(rFALR)，雙質粒工程菌的構建提高了目的蛋白的收率。其氨基酸組成與天然產物完全一致。
3、體內活性研究結果顯示，rFALR對CCl4導致的小鼠肝損傷后肝功能的恢復能力明顯優于rhALR，同時具有明顯的促進DNA合成作用。即與現有技術第一種方法中的目的產物相比，本發明的目的產物具有更高的體內生物學活性。同時巰基氧化酶活性也明顯高于現有技術第一種方法中的目的產物。
序列表11.txtSEQUENCE LISTING<110>華北制藥集團有限責任公司<120>一種新型促肝細胞生長因子、制備方法及其用途<130>
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<400>1atg cgg acg cag cag aag cgg gac acc aag ttt agg gag gac tgc ccg48Met Arg Thr Gln Gln Lys Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro1 5 10 15ccg gat cgc gag gaa ctg ggc cgc cac agc tgg gct gtc ctc cac acc96Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr20 25 30ctg gcc gcc tac tac ccc gac ctg ccc acc cca gaa cag cag caa gac144Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp35 40 45atg gcc cag ttc ata cat tta ttt tct aag ttt tac ccc tgt gag gag192Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu50 55 60tgt gct gaa gac cta aga aaa agg ctg tgc agg aac cac cca gac acc240Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys Arg Asn His Pro Asp Thr65 70 75 80cgc acc cgg gca tgc ttc aca cag tgg ctg tgc cac ctg cac aat gaa288Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys His Leu His Asn Glu85 90 95gtg aac cgc aag ctg ggc aag cct gac ttc gac tgc tca aaa gtg gat336Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys Ser Lys Val Asp100 105 110gag cgc tgg cgc gac ggc tgg aag gat ggc tcc tgt gac tag378Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp115 120 125<210>2<211>125<212>PRT<213>大腸桿菌(E.coli)<400>2Met Arg Thr Gln Gln Lys Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro1 5 10 15Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr20 25 30Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp35 40 45
序列表11.txtMet Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu50 55 60Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys Arg Asn His Pro Asp Thr65 70 75 80Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys His Leu His Asn Glu85 90 95Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys Ser Lys Val Asp100 105 110Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp
權利要求
1.一種新型重組人促肝細胞生長因子，其特征在于含有如序列表中序列2所示的氨基酸序列和FAD輔基。
2.一種能表達權利要求1的重組人促肝細胞生長因子的基因工程菌，其特征在于同時含有重組人促肝細胞生長因子和細菌素釋放蛋白的表達載體。
3.構建能表達權利要求1的重組人促肝細胞生長因子的基因工程菌的方法，包括含目的基因的載體的構建，然后轉化表達宿主菌(例如大腸桿菌、酵母菌等)。
4.構建能表達權利要求1的重組人促肝細胞生長因子的基因工程菌的方法，進一步包括引入可表達細菌素釋放蛋白(bacteriocin release proteinBRP)的質粒。
5.權利要求1的新型重組人促肝細胞生長因子在制備治療肝病的藥物中的用途。
6.權利要求5的用途，其中所述肝病為重癥肝炎、肝硬化或慢性活動性肝炎。
7.制備權利要求1的新型重組人促肝細胞生長因子的方法，包括以下步驟A、構建能同時含有重組人促肝細胞生長因子和細菌素釋放蛋白的表達載體的基因工程菌；B、培養該基因工程菌；和C、純化目標蛋白。
全文摘要
本發明涉及一種新型含有如序列表中序列2所示的氨基酸序列和FAD輔基的新型重組人促肝細胞生長因子，同時含有重組人促肝細胞生長因子和細菌素釋放蛋白的表達載體的基因工程菌，以及該工程菌的構建方法。
文檔編號A61P31/00GK1566154SQ0314859
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月7日 優先權日2003年7月7日
發明者董愛華, 郝愛魚, 鄭學麗, 王明珠, 賈茜, 楊志, 白玉, 趙智祥, 黃曉蘭, 吳洪濤, 王彥芳, 宋欣, 任樂民, 孔德清, 周興軍 申請人:華北制藥集團有限責任公司