專利名稱：靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種靶向于血小板源性生長因子受體-β (PDGFR-β)的主動靶向載藥系統及其制備方法。
背景技術：
肝纖維化是慢性肝病重要病理特征，是發展到肝硬化的必經階段。迄今為止國內外的研究就肝纖維化和早期肝硬化可以逆轉，已有共識。根據肝纖維化的發病機制，抗肝纖維化治療大致可分為3個范疇① 祛除肝損害的病因如乙型和丙型肝炎的抗病毒治療；Φ阻斷肝星狀細胞(HSC)的激活和增殖，并促進其凋亡；③促進細胞外基質(ECM)的降解。目前國內外的研究在抑制HSC活化并促進其凋亡、調節ECM的合成和降解、調控一些細胞因子和介質等方面取得一些成果， 對肝纖維化的臨床治療提供了一些藥物和方法，主要包括干擾素類(IFN-α和IFN-Y)、 細胞因子、抗炎保肝藥和一些中醫中藥等，但總體療效仍不理想。因此，在我們這樣一個肝病大國，加之慢性肝病繼續發展成肝硬化和肝癌，給人民大眾帶來較高的致死率和致殘率的情況下，探究理想有效的抗肝纖維化藥物和方法，意義深遠。分析限制抗肝纖維化藥物臨床應用的一些重要原因，包括藥物半衰期短、靶細胞周圍的有效藥物濃度不夠、療效較低和藥物全身系統作用帶來的非靶組織和細胞的副作用大等方面(Bataller R, et al. J. Clin. Invest 2005，115(2) :209-218.)。探尋解決這類問題的途徑和方法，以期能改善抗肝纖維化藥物的療效，最終服務于臨床治療，應對策略之一可通過主動靶向載藥系統轉運藥物，達到靶向釋藥的效果，就是將藥物限定于作用部位， 以達到最佳治療指數和減少作用于非靶向部位引起的副作用的目的，因此，針對肝纖維化相關靶細胞的主動靶向載藥系統為無良好治療效果或(和)有嚴重非靶細胞副作用的現有的臨床抗肝纖維化藥物的使用創造了新的機會。鑒于HSC激活在肝纖維化發展過程中的中心事件的地位，因此，HSC是抗肝纖維化治療的首選靶細。構建針對HSC的靶向載體，并通過載體轉運藥物，可達到靶向、增加療效及減少抗肝纖維化藥物的全身副作用的目的。近年來，有多種針對HSC靶向載藥系統的研究(Adrian, et al. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes 2007，1768( 6 ) 1430—1439 ；Mei jer DKF, et al. Journal of Con trolled Release 2001,72(1—3): 157—164; Sato, Y, et al. Nature Biotechnology!^, 26(4) : 431-442)，一些靶向載藥系統通過特異識別HSC表面優勢過度或特異性表達的受體而發揮HSC靶向作用，如與轉化生長因子(TGF^1)介質激活相關的針對甘露糖-6-磷酸酯酶/胰島素樣生長因子II型受體的甘露糖-6-磷酸酯酶修飾的人血白蛋白(M6P-HSA)靶向載藥系統；針對VI型膠原受體(VI-CR)的RGD環肽-HSA的靶向載藥系統；針對血小板源性生長因子受體β (PDGFR-β )的pPB環肽-HSA靶向載藥系統；針對視黃醇結合蛋白受體(RBP-R)的Vitamin A-脂質體的靶向載藥系統。血小板源性生長因子(PDGF)是肝纖維化形成過程中最強的促增殖因子，與轉化生
3長因子(TGF-h)在肝纖維化的形成中起著重要作用，而且PDGF受體β (PDGFR-β ) 已被廣泛的證明在激活的HSC上優勢過量表達(Pinzani Μ, et al. Am J Pathol 1996, 148785-800； Borkham-Kamphorst Ε, et al. Laboratory Investigation 2008, 88 (10) : 1090-1100)，相比于HSC上可被選擇的其它靶點(如VI-C受體)，優勢過度表達的PDGFR-β顯示出與肝纖維的發生和發展更密切的相關性。但由于PDGF作為肝纖維化過程中最強的促HSC的細胞絲裂原，影響到細胞的增殖和分化的重要作用，不能應用PDGF 全分子作為靶點的配體，已有研究(Clements JM, et al. EMBO J 1991, 10:4113-4120; Beljaars L, et al. Biochemical Pharmaco logy200 >, 66 (7) 1307-1317)蹄選并證實了結合的關鍵位點是PDGF分子27位R和30位I,包含這2個關鍵位點的pPB能與PDGFR- β結合。對載體表面添加配體結合位點，可構建成主動靶向載體。Beljaars L等(Beljaars L, et al. Biochemical Pharmacology 2003 ； 66 (7) 1307-1317)就利用 pPB 為靶向頭基， 人血白蛋白為載體構建了 PPB-HSA主動靶向載藥系統，并進一步證明了 pPB可與NIH/3T3 fibroblast細胞株上的PDGFR-β結合，但不會影響細胞內的信號傳導。同樣的研究團隊， 最近報道了他們構建的這個pPB-HAS主動靶向載藥系統遞送抗腫瘤藥物doxorubicin的實際應用(Prakash J, et al. Journal of Controlled Release 2010，145(2) : 91-101)。 另夕卜，Schoemaker MH等(Schoemaker ΜΗ, et al. Molecular Pharmaceutics 2008,5(3): 399-406)也利用pPB作為靶向頭基，腺病毒作為載體，構建了 pPB-腺病毒的主動靶向HSC 的基因載體。目前，藥物的聚乙二醇化和藥物包封于載體脂質體被認為是兩種很好的延長藥物在體內的半衰期、增加其穩定性、降低免疫源性的有效手段，這樣擴大了藥物的應用范圍，同時減少了刺激和毒副反應的發生。因此，相比于腺病毒載體的一些尚未解決的嚴重問題(Younes HM, et al. Journal of Pharmaceutical Sciences 2002， 91: 2—17)，月旨質體作為載體在臨床應用中更具有安全好、生物相容性好、載藥及靶向效果明確的優點，也是最早用于靶向給藥的載體，且于1992年美國FDA正式批準脂質體用于人類疾病的治療。相比于修飾的干擾素和修飾白蛋白的載體系統，脂質體作為載體具有載藥譜更廣、單體性、不引起蛋白分子空間結構的改變和非免疫原性的優點。目前臨床上應用的抗肝纖維化藥物，主要包括干擾素(IFN)類、細胞因子、抗炎保肝藥和一些中醫中藥等，雖然總的來說，并沒有令人滿意抗肝纖維化的臨床用藥，但在這些藥物中比較受肯定的是IFN類。IFN主要包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ 3種，其中IFN-α 和IFN-β更多的是通過其明顯的抗病毒作用而在慢性肝病的治療中發揮藥效。而IFN-γ 是由致敏的T淋巴細胞和NK細胞產生，它被證明具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、免疫調節和抗肝纖維化等作用。IFN-Y又稱免疫干擾素而不同于IFN-α、β，其抗病毒作用弱于IFN_a、β， 它更具有免疫調節作用，IFN-Y是目前已經被批準應用的抗肝纖維化作用藥物，在慢性肝病的治療中IFN-Y更多的是通過其抗肝纖維化作用，許多體內外實驗中表明，IFN-Y主要通過抑制HSC的激活、促進細胞的凋亡、降低ECM的沉積、抗炎、拮抗TGF-β工等細胞因子及直接抑制基質的合成及其促進基質的降解等方面。但在臨床應用中IFN-Y表現出相對低的療效、相對短的半衰期和一些嚴重的副作用，如發熱、血細胞減少、肝功能損害加重等，嚴重制約著IFN-γ的臨床應用。因此，需要研發靶向高效、高純度、大劑量和長效的IFN-Y。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有長循環性和靶向性并能提高抗肝纖維化藥物的藥效、減少其副作用的主動靶向載藥系統及其制備方法。為了達到上述目的，本發明提供了一種靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統，其特征在于，包括靶向于PDGFR-β的基團，所述的靶向于PDGFR-β的基團與抗肝纖維化藥物載體連接，抗肝纖維化藥物載體上擔載有抗肝纖維化藥物。優選地，所述的靶向于PDGFR-β的基團為靶向環肽，序列為半胱氨酸絲氨酸-精氨酸-天冬酰酸-亮氨酸-異亮氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸*(即C*SRNLIDC*，ρΡΒ)， *代表成環位置，其中精氨酸(R)和異亮氨酸(I)殘基是介導與靶細胞上PDGFR-β結合的位點，通過PPB與肝星狀細胞上優勢過度表達的PDGFR-β結合，而使該主動靶向載藥系統實現主動靶向，并避免非靶細胞受累引起的全身副作用。優選地，所述的抗肝纖維化藥物載體為空間穩定性脂質體(SSL)。優選地，所述的空間穩定性脂質體(SSL)為聚乙二醇化的脂質體。聚乙二醇化的脂質體可規避調理素的作用，避免網狀內皮系統的吞噬，進一步保障靶向脂質體主動靶向至靶細胞HSC，而不是更多的被肝臟中網狀內皮系統吞噬。優選地，所述的抗肝纖維化藥物為IFN-γ。本發明還提供了上述靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統的制備方法，其特征在于，具體步驟為分別合成靶向于PDGFR-β的基團和抗肝纖維化藥物載體，將靶向于 PDGFR-β的基團與抗肝纖維化藥物載體相連接。優選地，所述的靶向于PDGFR-β的基團的合成方法為采用Boc-氨基酸固相合成方法合成靶向環肽，序列為半胱氨酸絲氨酸-精氨酸-天冬酰酸-亮氨酸-異亮氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸*，*代表成環位置，作為靶向于PDGFR-β的基團。優選地，在所述的靶向環肽上引入保護性巰基，形成巰基化的靶向環肽。優選地，所述的抗肝纖維化藥物載體的合成方法為將蛋磷脂酰膽堿(EPC)Ji 固醇(Choi)、甲氧基-聚乙二醇■。- 二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(HiPE(^cici-DSPE)和馬來酰亞胺-聚乙二醇34(1(Γ 二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(HiaI-PEG34cici-DSPE)溶于有機溶劑中，蒸干有機溶劑，共同成膜，形成聚乙二醇化的脂質體，作為抗肝纖維化藥物載體。優選地，所述的聚乙二醇化的脂質體水化后，依次擠壓過400nm、200nm、IOOnm和 50nm孔徑的膜，得到納米級別的粒徑均一的脂質體。優選地，所述的靶向于PDGFR-β的基團上帶有巰基，所述的抗肝纖維化藥物載體上帶有馬來酰亞胺基，靶向于PDGFR-β的基團與抗肝纖維化藥物載體之間的連接通過巰基與馬來酰亞胺基之間的反應實現。本發明的有益效果如下
(1)、經試驗證明，本發明的主動靶向載藥系統具有長循環性和靶向性并能提高抗肝纖維化藥物的藥效、減少其副作用。(2)、本發明的靶向環肽可與PDGFR-β特異性結合，與其他非多肽的靶向載藥系統相比，小分子多肽作為靶向頭基具有化學結構明確，高純度并可被大量制備的優點。而且，環肽相比于線型多肽具有相對穩定的結構。(3)、立體穩定脂質體(SSL)的聚乙二醇化的設計，相比于普通脂質體，和保證達到納米粒級別(<100nm)的粒徑，能夠使它規避網狀內皮系統的吞噬，更具有長循環的特性及更能保障這樣的載藥系統傳送的藥物能夠克服顆粒性載體(包括脂質體)的擴散易受內皮屏障的主要內在缺陷，尤其是保障脂質體能通過由于肝纖維化時基底膜毛細血管化，通過孔徑變小的竇血管內皮屏障，達到靶細胞HSC所在的Disse間隙，真正實現主動靶向HSC。


圖1為環肽pPB的結構示意圖； 圖2為SSL-IFN- γ結構示意圖3為pPB-SSL-IFN- γ結構示意圖4為IFN-Y和pPB-SSL-γ在正常大鼠體內的藥代動力學曲線圖5為IFN-Y和pPB-SSL-IFN-γ在正常大鼠體內組織分布曲線圖6A為被SSL載體傳送的IFN- γ在纖維化肝臟中的細胞定位圖6B為被pPB-SSL載體傳送的IFN- γ在纖維化肝臟中的細胞定位圖7Α為治療4周后各組TAA大鼠肝組織的病理情況圖(HE染色，xlOO)。；
圖7B為各組大鼠肝組織的病理Ishak肝纖維化分期情況圖8A為各組TAA大鼠肝組織的I型膠原免疫組化染色圖(xlOO)，棕黃色指示陽性染
色；
圖8B為各組大鼠肝組織的I型膠原免疫組化染色面積的定量比較圖； 圖9為各組大血清IV-C水平的比較圖； 圖10為各組大鼠肝組織中α -SMA蛋白表達情況圖； 圖11為各組大鼠血清AST水平的比較圖； 圖12為各組大鼠的WBC計數比較圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例來具體說明本發明。實施例pPB-SSL-IFN-γ 的合成
第一步根據傳統的Boc-氨基酸固相合成方法，合成環肽C*SRNLIDC* (pPB) 稱取 Boc-Cys (Mbzl)-PAM 樹脂 0. Immol，在 DMF 中溶脹 15min，用 1%TFA 脫除 N-Boc 保護基團，用DMF反復沖洗；
稱取Boc-Asp (D)氨基酸0. 88mmol，溶解于含有縮合劑HBTU (用DMF配成0. 5M) Iml 和 0. 25ml DIEA (購自 Fluka-Sigma-Aldrich 公司，貨號 03440，CAS 號 7087-68-5)的混合溶液中，加入到上述脫保護的樹脂，反應20-30min從而在上述樹脂上連接Asp，用DMF洗滌， 用1%TFA脫保護，用DMF再洗滌；
按照上述方法，依次在上述樹脂上連接Asp、lie、Leu、Asn、Arg、Ser和Cys，用DMF洗滌樹脂，加入甲醇進行沉淀，干燥，將其于0°C加入含有5%對甲酚(p-cresol，g/ml)的無水 HF溶液30mL中，磁力攪拌Ih以切割樹脂，所得產物加入冷乙醚沉淀，得到線性多肽粗品； 在粗品中加入50%乙腈分散和沉淀，再旋轉蒸發去除乙腈，凍干得線性多肽CSRNLIDC， 高效液相色譜儀檢測其純度>95%，質譜法(ESI-MS)檢測其分子量與理論分子量相符，證實線性多肽的正確合成后，通過制備HPLC純化，再凍干得純品。
將二甲基亞砜加入到(pH=6. 0)的磷酸鹽緩沖溶液中，配成二甲基亞砜體積百分濃度為20vd%的二甲基亞砜磷酸鹽緩沖溶液，將所得的線性多肽純品以lmg/ml的濃度溶解于所述二甲基亞砜磷酸鹽緩沖溶液，在室溫下磁力攪拌過夜，二硫鍵(-S-S-)形成，線性多肽首尾成環，凍干得環肽PPB粗品，經HPLC檢測，ESI-MS測定其分子量證實線性多肽環化成功，經高效制備液相純化后，再凍干得PPB純品，_70°C保存待用，如圖1所示，為環肽pPB 的結構示意圖。第二步合成巰基化的pPB
根據文獻報道的利用N- 丁二酸，S-乙酰基巰基乙二醇酯OV-Succinimidyl S-Acetylthioacetate, SATA)或 N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸 OV-Succinimidyl S-Acetylthiopropionate, SATP )引入保護性巰基的方法(Beljaars, L, et al. Biochemical Pharmacology 2003,66(7):1307-1317 ；Instructions of SATA and SATP form PIERCE)；
將pPB溶解于DMF中配成pPB濃度為20mg/ml (10-30mg/ml皆可)的溶液，再加入 SATP，SATP與pPB的摩爾比為6 :1 (2 10 :1皆可)，最后加入20 μ 1的N，N 二異丙基乙胺 (DIEA)，在室溫條件下磁力攪拌反應，HPLC檢測，提示有pPB-SH出現，反應較完全后，終止反應，制備HPLC純化，凍干得pPB-SH純品，ESI-MS檢測其分子量。
上述方法中的SATP也可換成SATA，通過SATA或SATP方法引入巰基，巰基有乙酸鹽 (acetate, CH2CO-)的保護，因此，SATA或SATP修飾的多肽或蛋白可長期保存待用。第三步制備未接靶向頭基的立體穩定脂質體SSL和SSL-IFN- γ
牛艮據文獻 艮道的方法(Du SL, et al. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2007，322 (2) : 560-568)略加以修改，即將其膜成分中的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)換成(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)DSPE來制備SSL。具體制備方法按2 :1 :0. 1 :0. 02(摩爾比)分別稱取 EPC 20ymol、Chol ΙΟμπιοΙ、 mPEG2000-DSPE 1 μ mol 和 mal_PE(i34(1(1-DSPE 200nmol,溶于 4ml 氯仿中，然后將此溶液在 40。C 水浴的條件下，利用逐步減壓和旋轉蒸發的方法，蒸干有機溶劑，成膜，室溫真空干燥過夜后，加入2ml的PBS溶液(pH 7. 2)在冰浴條件下(4°C)振蕩池水化，得空白SSL ；
若加入2ml含有IFN- y (lxl06IU/ml)的PBS溶液(pH 7. 2)在冰浴條件下振蕩2h水化，得包封IFN-Y的SSL (SSL-IFN-Y)0通過CL-4B凝膠柱層析除去沒被包封的游離的 IFN- γ，再用Mini Extruder依次通過400nm-200nm-100nm-50nm孔徑的濾膜反復擠壓15 次/濾膜，得到粒徑均一的帶明顯藍色乳光的SSL-IFN- Y，如圖2所示，為SSL-IFN- γ結構示意圖，其中mPEG_-DSPE和mal-PEG34(1(1-DSPE的DSPE端插入脂質雙分子層，另一端朝外。第四步制備環肽pPB修飾過的立體穩定性脂質體
將第二步制得的PPB-SH按照與第三步制得的SSL-IFN- γ中mal-PE(i34(1(1-DSPE摩爾比為10 1的量加入到SSL-IFN- γ (ρΗ7· 2-7. 5皆可，具體操作時采用ρΗ7· 3)中，再加入 1/10體積的脫保護液(制備方法為將羥胺和EDTA溶解在PBS緩沖液中得到含有0. 5Μ羥胺和25mM EDTA的溶液，用NaOH調節pH為7. 3 (pH7. 2-7. 5皆可))以脫去pPB_SH的保護性 acetate，暴露出-SH與SSL-IFN-γ中的mal反應，室溫下磁力攪拌反應池，得到pPB修飾的SSL-IFN- γ，再通過CL-4B凝膠柱去除游離的pPB_SH，得純化的pPB_SSL_IFN- Y。如圖 3所示，為pPB-SSL-IFN- γ結構示意圖，用激光粒徑散射儀測定平均粒徑為83. 5nm,多分散系數為(PI)為0. 067 ；應用酶聯免疫吸附法測得IFN-Y的包封率為32. 73士4. 61% (n=3)； 載藥量為 8. 99xl04士0. 93 IU/ymol 磷脂。將上述步驟中的SSL-IFN- γ替換為SSL，制成pPB_SSL。應用例
利用實施例中得到的pPB-SSL-IFN- y、SSL-IFN- y、pPB-SSL以及目前臨床上應用的游離IFN-Y劑型進行對大鼠肝纖維化治療作用的對比研究，具體技術路線和結果如下 一、驗證pPB-SSL-IFN- γ的藥效學作用基礎長循環和靶向性 1 , IFN- γ和pPB-IFN-γ在正常大鼠體內的藥代動力學研究
0. 5ml 的 IFN-y (106IU/ml)和 pPB-SSL-IFN- γ (含 IFN-y 105IU/ml)經正常大鼠尾靜脈注入后，通過動態檢測不同時間點血液標本中IFN-Y的濃度，評估二者的藥代動力學規律。結果顯示IFN-Y和pPB-SSL-IFN-γ的半衰期分別是0. 234士0. 022h和 1. 146士0. 139h，后者明顯延長;pPB-SSL-IFN- γ的曲線下面積(AUC)明顯大于IFN-γ，如圖4所示，為血液中IFN-Y殘留率示意圖代表的藥代動力學曲線，以上結果均提示了被包封于pPB-SSL中的IFN-Y比較游離劑型的IFN-Y在血中消除明顯緩慢，較好地保持了其在血液中得濃度，延長了 IFN-Y有效的作用時間，提高了其有效的生物利用度，取得了藥物緩慢釋放的長循環效果。2、IFN- γ和pPB-SSL-IFN- γ在正常大鼠體內的組織分布的研究
(Iml) IFN-y (105IU/ml)和 pPB-SSL-IFN-γ (含 IFN-γ 1. 65xl04IU/ml)經正常大鼠尾靜脈注入后，24h時麻醉處死大鼠，取得心、肝、脾、肺、腎、腦和腸的標本，通過ELISA法檢測IOOmg相應組織中IFN-Y含量，評估二者的大鼠體內組織分布規律。結果顯示在藥物注入的24h時，包封于pPB-SSL中的IFN- γ主要集聚于肝臟中(Ρ<0. 0001),而游離IFN- γ 組主要集聚于肝臟和腸道中(Ρ<0. 0001)，如圖5所示，為IFN-Y和pPB-SSL-IFN-γ在正常大鼠體內組織分布曲線圖，進一步比較不同處理組中相同組織中IFN-Y的差異，在取得的心、肝、脾、肺、腎、腦、腸的標本中，pPB-SSL-IFN- γ處理組的IFN-γ的含量均明顯多于游離IFN- γ處理組(P<0. 05,圖中僅肝臟組織對比組有標識&，提示P<0. 05)。以上結果提示 pPB-SSL-IFN- γ的體內分布明顯的肝靶向性和相比于IFN-γ明顯的長循環性。3、免疫熒光組織化學法評估藥物在纖維化大鼠肝組織的細胞中的分布
采用免疫熒光組織化學雙標染色α-SMA和IFN-Y的方法，考察SSL-IFN-γ和 pPB-SSL-IFN- γ在纖維化肝組織中的細胞定位情況，具體操作如下
分別給予肝纖維化大鼠含有相同IFN- Y濃度Oxl05IU/ml)的SSL-IFN- γ和 pPB-SSL-IFN- Y各0. 5ml，尾靜脈注入。注入后濁時間點，取肝臟組織入冰凍切片包埋劑(OCT)，并-20°C恒冷切片機冰凍切片，4%多聚甲醛固定20min，IxPBS洗后， 加0. 2%Triton-100破膜3min，IxPBS洗后，加入m的牛血清白蛋白(BSA)室溫下封閉 30min，后加入兔抗大鼠a-SMA(稀釋倍數1:100，購自Millipore公司，Cat. #04-1094， Lot#NG1645432)和小鼠抗人IFN- Y (稀釋倍數1 50，購自北京博奧森公司，貨號 bsm-0388M), 4°C孵育過夜后，IxPBS洗，加入異硫氰熒光素(FITC)標記的山羊抗兔IgG (1 100，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，貨號HH012-1，為美國進口分裝產品)和羅丹明ahodamine)標記的山羊抗小鼠IgG (稀釋倍數1 :100，購自上海麥約爾生物技術有限公司，Cat. NO. RSA0001),室溫下孵育30min, IxPBS洗后，加4，，6- 二脒基-2-苯基吲哚
8(DAPI，稀釋倍數1 :2000，購自碧云天生物技術研究所，產品編號C1002)，染核lmin，IxPBS 洗。50%甘油/PBS封片，熒光顯微鏡下觀察、記錄，并計算IFN-Y和α-SMA共標陽性細胞率。
如圖6Α和圖6Β所示，為被SSL和pPB-SSL載體傳送的IFN- γ在纖維化肝臟中的細胞定位圖，圖中清晰的顯示了被pPB-SSL傳送的IFN- γ主要分布在肝細胞界板之間的Disse 間隙區域；而被SSL傳送的IFN-γ更多的分布在肝細胞界板區域的肝細胞漿。進一步計算pPB-SSL-IFN- γ處理組IFN-γ陽性細胞占α -SMA陽性細胞為60. 13 士9. 15%，明顯高于 SSL-IFN-γ 處理組(12. 11 士3. 26%) (η=3, Ρ<0. 01)，提示了 pPB-SSL 傳送的 IFN-γ 在纖維化肝臟中的細胞定位主要是肝星狀細胞，但SSL傳送的IFN-Y主要被肝臟中占絕大多數的肝細胞內吞，表明了被PPB-SSL載體包封的IFN-Y肝星狀細胞靶向性明顯優于被SSL 包封的IFN-Y。以上實驗驗證了實施例中制備的pPB-SSL-IFN-γ具有長循環性和肝靶向性，且在纖維化大鼠肝臟明顯的HSC靶向性。二、考察和驗證pPB-SSL-IFN-γ增強的抗肝纖維化作用和改善某些副作用的效果
1、實驗分組和干預處理方法
大鼠腹腔注射0. 2g/kg硫代乙酰胺(TAA)，每周2次，8周時，病理證實肝纖維化已經形成，繼續腹腔注射0.2g/kgTAA，造膜至10周，隨機選取40只大鼠分成5組(n=8)，開始給予藥物干預處理，分別為①對照組；②低劑量IFN-γ組 > 高劑量IFN-γ組P SSL-IFN- γ組；⑤pPB-SSL-IFN- γ組，其中①對照組又分成Ph汪入組(模型對照組)和空白pPB-SSL注入組(η=4)；②(I)⑤組中含有的IFN-γ濃度均為hl05IU/ml 一組中含有的IFN-Y濃度為106IU/ml，每周2次，每次0.5ml相應的藥物尾靜脈注射，共4周。整個實驗過程中，6只正常大鼠，作為正常對照組，在同樣條件下隨同飼養。2、實驗標本的留取和觀察指標的選擇
藥物干預處理4周后，最后1次給藥4 后，水合氯醛麻醉后，下腔靜脈取血和取肝組織，并處死動物。全血離心得血清標本，-20 0 C保存，一批次采用全自動生化儀檢測血肝功能(丙氨酸轉氨酶，ALT ；門冬氨酸轉氨酶，AST ；白蛋白，ALB)指標；采用放射免疫法檢測血清肝纖維化指標(透明質酸，HA和IV型膠原，IV-C)指標。EDTA抗凝血，一批次檢測血液分析指標。肝組織標本分成兩份，一份進行4%的中性甲醛進行固定，行病理檢測，采用HE染色、Masson三色膠原纖維染色、I型膠原的免疫組織化學染色；另一份肝組織置于液氮中速凍，進一步行western blot檢測和肝組織羥脯氨酸含量的測定。3、實驗結果和結論
這部分的研究要考察和評價不同劑型中的IFN-Y的抗肝纖維化療效，如上所述，本發明選擇了肝組織病理肝纖維化分期和炎癥分級、肝組織中羥脯氨酸含量、肝組織中I型膠原的面積定量、肝組織中α -SMA的蛋白表達、血清學肝纖維化指標(HA和IV_C)和血液分析(白細胞計數，WBC ；血紅蛋白，HGB ；血小板，PLT)作為考察指標。pPB-SSL-IFN- γ治療組顯示了明顯增強的抗大鼠肝纖維化的療效，具體表現在 與模型對照組、低劑量IFN- γ組(IFN- γ )、高劑量IFN- γ組(5xIFN_ y )和SSL-IFN- γ組相比，pPB-SSL-IFN-γ組大鼠的病理肝纖維化分期明顯減輕(如圖7A和7B所示)、1型膠原染色面積明顯減少(如圖8A和8B所示)、血清IV-C的水平(如圖9所示)和肝組織α -SMA 蛋白表達水平(如圖10所示)明顯下降。 本發明進一步考察了 pPB-SSL-IFN-γ是否改善IFN-γ的一些副作用，結果顯示①pPB-SSL-IFN- γ治療組大鼠的AST水平明顯低于SSL-IFN- γ治療組(如圖11 所示)，考慮由于SSL載體的非靶向性，IFN-Y容易被肝細胞內攝入，而帶有明顯HSC靶向的？ 8-551^載體系統會選擇性的傳送0^-^靶向于HSC，因此，IFN-Y引起的肝細胞損傷指標AST明顯好轉；③IFN- γ和hIFN- γ能明顯減少WBC計數水平，而pPB_SSL_IFN- γ 治療組的WBC計數高于IFN- γ和5xIFN- γ (如圖12所示)，盡管P=O. 07和P=O. 072 沒有達到Ρ<0. 05的統計學意義的差別，但P已非常接近0. 05，提示也許增加樣本量， pPB-SSL-IFN-y劑型能夠改善游離IFN-γ藥物劑型造成的WBC降低，可達統計學意義。因此，pPB-SSL-IFN- γ的HSC靶向性顯示了比SSL-IFN- γ制劑類型更有效的改善AST升高的效果，還可在一定程度上改善IFN- γ造成的WBC減少。
權利要求
1.一種靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統，其特征在于，包括靶向于PDGFR-β的基團，所述的靶向于PDGFR-β的基團與抗肝纖維化藥物載體連接，抗肝纖維化藥物載體上擔載有抗肝纖維化藥物。
2.如權利要求1所述的靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統，其特征在于，所述的靶向于PDGFR-β的基團為靶向環肽，序列為半胱氨酸絲氨酸-精氨酸-天冬酰酸-亮氨酸-異亮氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸*，*代表成環位置。
3.如權利要求1所述的靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統，其特征在于，所述的空間穩定性脂質體為聚乙二醇化的脂質體。
4.如權利要求3所述的靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統，其特征在于，所述的抗肝纖維化藥物為IFN-Y。
5.權利要求1所述的靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統的制備方法，其特征在于， 具體步驟為分別合成靶向于PDGFR-β的基團和抗肝纖維化藥物載體，將靶向于PDGFR-β 的基團與抗肝纖維化藥物載體相連接。
6.如權利要求5所述的靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統的制備方法，其特征在于，所述的靶向于PDGFR-β的基團的合成方法為采用Boc-氨基酸固相合成方法合成靶向環肽，序列為半胱氨酸絲氨酸-精氨酸-天冬酰酸-亮氨酸-異亮氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸*，*代表成環位置，作為靶向于PDGFR-β的基團。
7.如權利要求6所述的靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統的制備方法，其特征在于，在所述的靶向環肽上引入保護性巰基，形成巰基化的靶向環肽。
8.如權利要求5所述的靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統的制備方法，其特征在于，所述的抗肝纖維化藥物載體的合成方法為將蛋磷脂酰膽堿、膽固醇、甲氧基-聚乙二醇2__ 二硬酯酰磷脂酰乙醇胺和馬來酰亞胺-聚乙二醇二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶于有機溶劑中，蒸干有機溶劑，共同成膜，形成聚乙二醇化的脂質體，作為抗肝纖維化藥物載體。
9.如權利要求8所述的靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統的制備方法，其特征在于，所述的聚乙二醇化的脂質體水化后，依次擠壓過400歷、200歷、IOOnm和50nm孔徑的膜， 得到納米級別的粒徑均一的脂質體。
10.如權利要求5所述的靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統的制備方法，其特征在于，所述的靶向于PDGFR-β的基團上帶有巰基，所述的抗肝纖維化藥物載體上帶有馬來酰亞胺基，靶向于PDGFR-β的基團與抗肝纖維化藥物載體之間的連接通過巰基與馬來酰亞胺基之間的反應實現。
全文摘要
本發明提供了一種靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統及其制備方法，所述的靶向于PDGFR-β的基團為靶向環肽，其特征在于，包括靶向于PDGFR-β的基團，所述的靶向于PDGFR-β的基團與抗肝纖維化藥物載體連接。上述靶向于PDGFR-β的主動靶向載藥系統的制備方法，其特征在于，具體步驟為分別合成靶向于PDGFR-β的基團和抗肝纖維化藥物載體，將靶向于PDGFR-β的基團與抗肝纖維化藥物載體相連接。經試驗證明，本發明的主動靶向載藥系統具有長循環性和靶向性并能提高抗肝纖維化藥物的藥效、減少其副作用。
文檔編號A61P1/16GK102228694SQ20111016239
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月16日 優先權日2011年6月16日
發明者李清華, 李鋒, 王吉耀, 謝操, 陸偉躍 申請人:復旦大學, 復旦大學附屬中山醫院