專利名稱：羥基積雪草苷在制備治療肝纖維化藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及積雪草的用途，尤其是積雪草在制備治療肝纖維化藥物中的用途，特別涉及羥基積雪草苷在制備治療肝纖維化藥物中的用途。
背景技術：
肝纖維化是肝臟纖維結締組織異常增生的一種病理狀態，是慢性肝病發展為肝硬化的必經階段。以肝細胞損傷，通過旁分泌作用激活肝星狀細胞(Hsc)，使其過量合成和分泌細胞外基質(ECM)、促炎癥及纖維化細胞因了為特征。隨著肝臟病變的發展，肝細胞變性、壞死，再生結節，假小葉和纖維隔形成，肝正常結構遭到破壞，結果使肝臟變硬(肝硬化)，進一步可發展為肝癌。西藥對肝纖維化尚無有效治療方法，僅以秋水仙堿為主要治療藥物，但長期應用，毒副反應較大。國外的研究還多集中于基礎方面，以期在逐漸明了的肝纖維化形 成機理中尋找突破口，而中藥抗肝纖維化研究從臨床觀察和動物實驗入手，其初步結果已顯示出巨大的潛力。積雪草又名落得打、崩大碗、馬蹄等，分布于我國江南各地，為唇形科植物。中醫認為其性微寒、味苦、辛、有清熱除濕、解毒利尿作用，常用于治療外感風寒。從臨床實踐中發現積雪草對預防各種肝炎所致的肝纖維化和肝硬化效果良好。但是積雪草中含有多種成分，具體是哪種成分發揮預防和治療肝纖維化和肝硬化作用不明，這極大地阻礙了積雪草在治療肝纖維化和肝硬化中的應用。本發明從積雪草中提取出羥基積雪草苷，并利用肝纖維化大鼠模型對羥基積雪草苷治療肝纖維化進行了基礎研究，結果表明，羥基積雪草苷可明顯減少大鼠肝纖維化、肝硬化。

發明內容
本發明的目的在于提供羥基積雪草苷的新用途，即羥基積雪草苷在制備治療肝纖維化藥物中的用途。本發明的另一目的在于提供一種治療肝纖維化的羥基積雪草苷注射劑及其制備方法。為了實現上述發明目的，本發明利用肝硬化大鼠模型進行羥基積雪草苷阻斷肝纖維化病理基礎的基礎研究，結果表明羥基積雪草苷可明顯減少實驗大鼠肝纖維化和肝硬化。羥基積雪草苷在制備治療肝纖維化藥物中的用途。所述的羥基積雪草苷制備成注射劑。所述的注射劑為靜脈注射劑、動脈注射劑和皮下注射劑。所述的羥基積雪草苷注射劑劑，由2 15g藥物活性成分羥基積雪草苷溶解在IOOOml的膠束溶劑系統中制得，所述的膠束溶劑包括15°/Γ30%的表面活性劑和70°/Γ85%的溶劑。所述的注射劑由2 15g藥物溶于IOOOml的溶劑中，并通過濾膜制備得到。所述的表面活性劑包括吐溫20、吐溫85或兩者混合。
所述的溶劑是磷酸緩沖液、生理鹽水、羧甲基纖維素溶液、聚乙二醇溶液、丙二醇。所述的羥基積雪草苷注射劑的制備方法，取表面活性劑，放于量瓶中，加入羥基積雪草苷，震蕩至完全溶解，加入PH 7.0磷酸緩沖液(PBS)至刻度，充分混勻后放于50°C水浴上加熱30min，放置6小時至溶液系統平衡，通過濾膜，制成羥基積雪草苷注射液。所述的羥基積雪草苷注射劑的制備方法，取2 15g羥基積雪草苷，加入到IOOOml的溶劑中，攪拌，溶解完全后過濾膜即得。羥基積雪草苷在酸性條件下的水中溶解，易溶于乙醇、丙烯、吡啶。目前國外積雪草總苷的注射劑多以丙烯或PH3. 5左右的注射用水為基質。丙烯會引起注射部位嚴重疼痛的不良反應，PH3. 5超過了注射劑的pH范圍4 9，而且過低的pH值出了會帶來注射疼痛夕卜，還增加了對臟器、血管等損傷的風險。為增加羥基積雪草苷溶解度，減少注射部位疼痛，我們開發了膠束溶劑系統，包括10%的表面活性劑和90%的磷酸鹽緩沖液，pH 7. O (PBS)0這個表面活性劑可以是吐溫20和吐溫85。當吐溫20和吐溫85的比例從0:1(Γ 0:0之間 變化時，積雪草提取物的有效成分單體的溶解度隨之上升疒26倍(與單純在PBS7. O中比較
O.7mg/ml)，膠束的粒徑也隨之降低。在吐溫20和吐溫85的比例為6:4、8:2和10:0時，羥基積雪草苷的溶解度可高達10 mg/ml以上，膠束的粒徑低于2μπι。在55°C的環境中貯存60天，未發現含量、有關物質等項目發生明顯變化。滲透壓與以丙烯或pH3. 5左右的注射用水為基質的注射劑相比，明顯降低，與生理鹽水的滲透壓更為相似。本發明提供了積雪草的一個單體羥基積雪草苷的新用途，在制備治療肝纖維化藥物中的用途，并且提供了一種治療肝纖維化的羥基積雪草苷注射劑及其制備方法，有效拓寬了肝纖維化和肝硬化患者的選擇，而且和現有的治療肝纖維化藥物比較，本發明具備療效好、不良副作用小的優點。為了進一步合理利用羥基積雪草苷，我們對羥基積雪草苷做了抗肝纖維化的實驗研究，以二甲基亞硝胺誘導大鼠肝纖維化模型，采用超聲波引導下肝臟內注射的方法，觀察血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)等指標，研究羥基積雪草苷對實驗性大鼠肝纖維化的防治作用。材料與方法
I、動物及分組健康SD大鼠84只，雌雄各半，體重(180 士 20) g，隨機分為6組。分別為正常組(假手術組，給予生理鹽水)、模型組、秋水仙堿組(mg/kg)、羥基積雪草苷腹腔注射組(3mg/kg, ip)、輕基積雪草苷大劑量組(6mg/kg)、輕基積雪草苷中劑量組(3mg/kg)、輕基積雪草苷小劑量組(I. 5mg/kg)02、藥物羥基積雪草苷注射劑，來源于杭州賽利藥物研究所有限公司，將藥物配制成不同濃度供大、中、小劑量組應用，4 °C冰箱保存。3試劑和儀器秋水仙堿，由昆明制藥集團股份有限公司生產，批號980732，配制成10mg/L混懸液，4°C冰箱保存。DMN，上海開明化學廠生產，化學純，批號01610720，實驗時配制成O. 5%的溶液。HA放免試劑盒、LN放免試劑盒，均由上海海軍醫學研究所提供。SupenlOOO型全自動生化儀，美國ASCA制造。SN-682型放射免疫X計數器，上海原了能研究所日環儀器廠制造，HitachiEUB-40型超聲機，日立公司制造。4、方法
4.I造模方法用生理鹽水將DMN配成O. 5%的溶液，大鼠腹腔注射DMN每次10mg/kg(2ml/kg)，共12次，第I周每天I次，連續3天，第2 4周每周各I次，第5 7周均每天I次，連續2天，至模型建立。4. 2藥物肝內直接注射模型大鼠麻醉后仰臥固定于操作臺上，上腹部備皮、消毒，用HitachiEUB-40型超聲機3. 5MHz探頭作肝臟定位導引。穿刺注射采用O. 25ml注射器，5號注射針頭，注射速度O. 6ml/min，分別多點緩慢地注入大鼠肝臟各葉的邊緣，間距5mm,進針深度5_。注射部位用絲線縫合標記。4. 3觀察指標及檢測方法2周后，同上麻醉動物，腹主動脈取血制備血清，-200C冰箱保存，分別檢測血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)的含量。采血后取肝臟稱重，并取左葉肝臟置10%福爾馬林溶液中固定，HE染色，行病理組織學觀察肝組織纖維化程度((Γ4級)。5、統計學方法數據以X 士 s表示，采用SPSS11. O軟件進行處理。多組資料間比較采用ANOVA分析，肝組織纖維化程度采用等級序值法。實驗結果
I、羥基積雪草苷對肝纖維化大鼠血清TP及ALB的影響見表I。羥基積雪草苷腹腔注射組、大劑量組、中劑量組、小劑量組與模型組比較，TP及ALB變化均不明顯(P>0. 05)。2、羥基積雪草苷對肝纖維化大鼠血清ALT及AST含量的影響見表I。羥基積雪草苷腹腔注射組、大劑量組、中劑量組、小劑量組及秋水仙堿組與模型組比較，均可降低ALT及 AST 水平(Ρ〈0·01 或 Ρ〈0· 05)。3、羥基積雪草苷對肝纖維化大鼠血清HA及LN含量的影響見表I。羥基積雪草苷腹腔注射組、大劑量組、中劑量組、小劑量組及秋水仙堿組與模型組比較，HA水平降低，但對LN的影響不明顯。表I羥基積雪草苷對肝纖維化大鼠血清TP、ALB、ALT、AST、HA及LN的影響(x土 s)
權利要求
1.羥基積雪草苷在制備治療肝纖維化藥物中的用途。
2.根據權利要求I所述的用途，其特征在于所述的羥基積雪草苷制備成注射劑。
3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于所述的注射劑為靜脈注射劑、動脈注射劑和皮下注射劑。
4.根據權利要求2所述的用途，其特征在于所述的羥基積雪草苷注射劑劑，由2 15g藥物活性成分羥基積雪草苷溶解在IOOOml的膠束溶劑系統中制得，所述的膠束溶劑包括15% 30%的表面活性劑和70% 85%的溶劑。
5.根據權利要求3所述的用途，其特征在于所述的注射劑由2 15g藥物溶于IOOOml的溶劑中，并通過濾膜制備得到。
6.根據權利要求4所述的用途，其特征在于所述的表面活性劑包括吐溫20、吐溫85或兩者混合。
7.根據權利要求4或5所述的用途，其特征在于所述的溶劑是磷酸緩沖液、生理鹽水、羧甲基纖維素溶液、聚乙二醇溶液、丙二醇。
8.根據權利要求2 4所述的羥基積雪草苷注射劑的制備方法，其特征在于取表面活性劑，放于量瓶中，加入羥基積雪草苷，震蕩至完全溶解，加入PH 7.0磷酸緩沖液(PBS)至刻度，充分混勻后放于50°C水浴上加熱30min，放置6小時至溶液系統平衡，通過濾膜，制成羥基積雪草苷注射液。
9.根據權利要求5所述的羥基積雪草苷注射劑的制備方法，取2 15g羥基積雪草苷，加入到IOOOml的溶劑中，攪拌，溶解完全后過濾膜即得。
全文摘要
本發明涉及積雪草的用途，尤其涉及積雪草中的單體羥基積雪草苷在制備治療肝纖維化藥物中的用途。本發明還提供了治療肝纖維化的羥基積雪草苷注射劑 及其制備方法。本發明有效拓寬了肝纖維化和肝硬化患者的選擇，而且和現有的治療肝纖維化藥物比較，本發明具備療效好、不良副作用小的優點。
文檔編號A61K31/7024GK102973581SQ20111026330
公開日2013年3月20日 申請日期2011年9月7日 優先權日2011年9月7日
發明者范敏華, 魏巍, 周學來 申請人:杭州賽利藥物研究所有限公司, 海南普利制藥有限公司, 浙江瑞達藥業有限公司