專利名稱：微生物感染的治療的制作方法
技術領域：
本發明涉及人或動物體微生物感染的治療，如金黃色葡萄球菌，特別是抗生素耐藥生物菌株如MRSA。本發明提供了治療微生物如金黃色葡萄球菌感染的藥物，制備治療感染藥物的方法，治療感染的含有藥物的藥物包裝，和治療由所述微生物所致的感染的人或動物體方法。
多藥耐藥(MDR)在革蘭氏陽性細菌中是越來越多的問題(Banergee，S.N.等人.1991，Am.J.Med.91865-895；Shaberg，D.R.等人，1991，Am.J.Med.suppl.，8872-75；Gaynes，R.P.等人，1994，Infect.Dis.Clin.Pract.，6452-455)，特別是在醫院內。特別地，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)，特別是耐甲氧西林CNS，由于對所有青霉素類和頭孢菌素類耐受，證實是成問題的。對其它藥物如喹諾酮類是普遍耐受的(Malabarta，A.等人，1997，Eur.J.Med.Chem.，32459-478；Lewis，K.，1994，TIBS，19119-123；Traub，W.H.等人，1996，Chemotherapy，42118-132)。用萬古霉素或替考拉寧治療通常是有效的。但是，對這些藥物的耐受正在不斷增加，因此需要新的治療。例如，Hubert SK等人，(J Clin Microbiol.1999 Nov；37(11)3590-3；PMID10523558)論述了對萬古霉素和替考拉寧敏感性下降的金黃色葡萄球菌分離種群。已經發現，某些流行的MRSA菌株包括EMRSA-15(www.phls.org.uk，Public Health Laboratories，Colindale，UK)可以產生對萬古霉素耐受性增加的亞克隆(Burnie J等人，Clin Infect Dis.2000 Sep；31(3)684-9；PMID11017816)。曾經希望linezolid能對目前的治療中提供更需要的選擇，但Tsiodras S.等人(Lancet.2001 Jul 21；358(9277)207-8；PMID11476839)報道了在用此抗生素治療透析相關腹膜炎的患者中臨床分離出的一種耐受linezolid的MRSA。
此外，為有效治療感染，特別是對所用的抗生素(類)顯示耐受的感染，而給予患者的大劑量這種抗生素，是細胞毒的和腎毒性的，盡管有助于挽救患者的生命，但可以引起嚴重的副作用。
對葡萄球菌感染的治療和診斷先前在本領域中被廣泛地討論，特別是相關的公開物包括WO98/01154、WO99/50418和EP 0786519。抗生素耐受的原因也在公開物中被討論，如Allignet J.(Gene 1997 Nov 20；202(1-2)133-8；PMID9427556)。
因此，明顯的需要對微生物，特別是金黃色葡萄球菌感染的新的和更強的治療。
本發明者現在已發現，特殊的聯合藥劑，即具有新的抗原結合部分的抗體(詳述如下)與糖肽抗生素(如萬古霉素或替考拉寧)，有非常驚人的協同治療效果——與單獨使用相比，糖肽抗生素的治療有效性明顯地提高了。特別是在被治療的微生物對糖肽抗生素耐受的情況下。重要地，通過萬古霉素與SEQ ID NO2的抗體一起使用，本發明能夠有效治療萬古霉素完全耐藥和萬古霉素中度耐藥的金黃色葡萄球菌菌株。此前，現有技術中沒有提示可能獲得此結果。糖肽抗生素通過影響細菌細胞壁發揮作用。其它的抗生素如青霉素類也影響細菌細胞壁。但是，本發明者發現，它們的有效性沒有通過與SEQ ID NO2的抗體一起使用而改善。特別地，實驗顯示，與SEQID NO2的抗體一起使用，氟氯青霉素的有效性沒有改善。使用SEQ ID NO2的抗體，耐受氟氯青霉素的細菌的耐受性沒有下降。
按照本發明，提供了具有SEQ ID NO2序列的抗體或其抗原結合片段。抗體由SEQ ID NO1的核苷酸序列編碼，盡管核苷酸序列當然可以容易地被修飾以，例如，優化用于合成該核苷酸的特定微生物的密碼子，或為其它原因所需的密碼子。
SEQ ID NO2抗體(也稱作″Aurograb″RTM)是人的遺傳重組體抗體。它與免疫顯性細胞表面抗原GrfA結合，后者是葡萄球菌ABC轉運子蛋白(WO 99/50418；Burnie JP等人，Infect Immun.2000 Jun；68(6)3200-9；PMID10816464)。最初，它來自金黃色葡萄球菌敗血癥康復并產生GrfA抗體的患者。它具有內在的抗葡萄球菌活性，并在體外和體內顯示與萬古霉素和其它糖肽抗生素協同對抗廣譜金黃色葡萄球菌菌株，包括MRSA和萬古霉素耐藥MRSA。SEQ ID NO2抗體的抗菌活性，無論單獨還是與糖肽抗生素聯合，都顯著地有助于金黃色葡萄球菌感染的治療。
人血漿來源的免疫球蛋白(Ramisse F等人，J Infect Dis.1993Oct；168(4)1030-3；PMID8376815)和兔抗GrfA產生的超免疫抗血清，都在葡萄球菌感染模型中有保護作用(見下面的″實驗″章節)。對GrfA特異的人重組體抗體在MRSA感染小鼠模型中有保護作用。GrfA的特殊氨基酸序列，即SEQ ID NO3的抗原決定簇，被發現經常地為金黃色葡萄球菌敗血癥康復患者的體液免疫反應所靶向(Burnie JP等人，2000見上)。
但是，現有技術中沒有提示采用糖肽抗生素如萬古霉素、替考拉寧和達托霉素，與抗GrfA抗體聯合應用可有效改善對微生物感染如金黃色葡萄球菌感染的治療，特別地，沒涉及對SEQ ID NO3抗原決定簇特異的抗體，更特別地，沒涉及具有SEQ ID NO2序列的抗體。
因此，按照本發明，提供了含有治療有效量的糖肽抗生素和特異性抗GrfA的抗體的藥物，特別是特異性抗SEQ ID NO3抗原決定簇的抗體。還提供了制備該藥物的方法、藥物包裝和全部包含或使用相同藥物的治療方法。該藥物可用于治療金黃色葡萄球菌感染。如這里所用，術語″治療″是指設計用來治愈、緩解、去除或減輕這種感染癥狀的任何治療，或用來防止或減少其感染的可能性，包括預防。
GrfA蛋白，即ABC轉運子蛋白，已經從金黃色葡萄球菌中分離和純化，但在其它生物體中存在具有相同功能的同源物，它們可被用作治療靶標。因此，可以制備抗非金黃色葡萄球菌微生物產生的GrfA同系物的抗體，并可與糖肽抗生素一起使用以有效治療患者的微生物感染。治療可以產生效果的其它微生物實例是其它的葡萄球菌，特別是凝固酶陰性的葡萄球菌，如溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌。也可以治療腸球菌感染，特別是糞腸球菌和屎腸球菌，如可以治療棒狀桿菌如杰式棒狀桿菌和干燥棒狀桿菌所致的感染。
GrfA同系物與GrfA可具有至少60％的序列同源性，例如至少70、80、85、90、95、96、97、98、99或99.5％的序列同源性。采用NCBIBLASTN(核苷酸序列比較)或BLASTP(多肽比較)程序，2.1.2版，以默認參數可確定GrfA序列同系物。NCBI BLAST程序可見www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/。這里所用的術語序列同一性是指最佳排列序列的氨基酸殘基，其在相應的相對位置上正確地匹配。
在非金黃色葡萄球菌的生物體中，特別是其它的葡萄球菌中，產生抗體并作為治療基礎的抗原決定簇(SEQ ID NO3)仍然可能是相同的。
因此，按照本發明，提供了治療感染的藥物，特別是金黃色葡萄球菌感染，該藥物含有治療有效量的糖肽抗生素和SEQ ID NO2抗體或其抗原結合片段。
還提供了用于制備治療感染藥物的方法的糖肽抗生素和SEQ ID NO2抗體或其抗原結合片段。
在實施抗感染治療中，特別是金黃色葡萄球菌感染，糖肽抗生素和抗體或抗原結合片段可以分別地或連續地給予患者。按照本發明還提供了含治療有效量的糖肽抗生素和SEQ ID NO2抗體或其抗原結合片段的藥物包裝。
按照本發明還提供了使用糖肽抗生素和SEQ ID NO2抗體或其抗原結合片段制備治療感染的藥物，特別是金黃色葡萄球菌感染。
按照本發明還提供了在患者中治療感染的方法，特別是金黃色葡萄球菌感染，包括給予該患者治療有效量的糖肽抗生素和SEQ ID NO2抗體或其抗原結合片段的步驟。
在本發明中特別使用的糖肽抗生素是萬古霉素、替考拉寧和達托霉素，盡管本發明當然延伸至糖肽抗生素家族的其它成員。
這里所用的各種語法形式的術語″抗體″是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學活性部分，即包含抗體結合位點或抗體結合部位的分子。這種分子也稱作免疫球蛋白分子的″抗原結合片段″。
舉例說明的抗體分子是完整的免疫球蛋白分子、實質上完整的免疫球蛋白分子和包含抗體結合部位的免疫球蛋白分子部分，包括本領域已知的Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv和F(v)部分。
術語″抗體結合位點″是指由重和輕鏈可變和超變區組成的抗體分子的結構部分，特異地與抗原結合(與之發生免疫反應)。
關于SEQ ID NO2抗體，它可被容易地修飾以改變其氨基酸序列，同時呈現相同的抗體結合部位并保持其抗原結合特異性。總的來說，其結構被排列(氨基至羧基末端序列)成通過連接子共價連接在一起的人免疫球蛋白可變重結構區(VH)和可變輕鏈(VK)，并具有His羧基末端序列。
每一個可變區由互補決定區CDR1、CDR2和CDR3組成，它們是界定抗體的抗原結合特異性的基礎，即抗體結合部位。本發明者發現，在這些區中，VH區的CDR3部分在界定抗原特異性中是最重要的。關于抗體的進一步講授可在本領域廣泛獲取，如Harlow，E.和Lane，D.，″抗體應用實驗室手冊″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1998。通過關于抗體結合位點的抗體結合部位界定部分的公共常識和上述講授，本領域技術人員能夠容易地修飾SEQ ID NO2序列以產生具有相同抗體結合部位的可選擇抗體，使之獲得相同或相似的治療效果。
例如，SEQ ID NO2抗體的抗原結合片段可容易地通過簡單地去除一個或多個羧基末端His殘基而制備。其它的修飾實例包括接枝SEQID NO2抗體的超變區(互補決定區)到不同于SEQ ID NO2的可變結構區上，使得到的抗體仍然具有相同的抗體結合部位(見如，EP 239400和類似文獻)。
″治療的改善″的意思是，指定劑量的糖肽抗生素與本發明抗體一起給予患者時比單獨用藥具有更大的治療效果。相似地，同單獨給予糖肽抗生素相比，與本發明抗體一起用藥可以用較小劑量的糖肽抗生素在患者中獲得所需的治療效果。特別是在微生物如金黃色葡萄球菌對糖肽抗生素耐受的情況下。這對于減少任何治療副作用可以是非常有用的。
即使金黃色葡萄球菌是耐藥的，通過給現有的糖肽抗生素“恢復力量(second wind)”并使其對如金黃色葡萄球菌感染的治療有效，本發明提供了藥物和治療方法，其安全性和有效性可以容易地被評價且不涉及新的物質種類—糖肽抗生素的安全性參數已熟知并可應用于本發明。相似地，應用抗體作為本發明中的其它活性成分是相對簡單的安全性問題。特別地，當抗體是以人抗體序列的重組抗體片段形式時，其免疫原性將會非常地低。此外，應用在非常短的時間內(例如數天)給予抗體的治療方案意味著患者的免疫系統不容易形成對其的免疫反應。因此，由產生抗本發明抗體的抗體而引起的有害超敏型反應及免疫復合物的形成/沉積是非常小的。
SEQ ID NO2的抗體也有若干特殊的優勢——它沒有能夠激發補體沉積和巨噬細胞結合的Fc部分，因此不太可能引起能夠導致炎癥和組織損害的不適當的補體級聯活化。
由于不使用動物來源的產物生產本發明抗體，給患者引入人或動物感染性疾病病因或致癌基因的可能性能夠被避免。
本發明藥物的治療方案和劑量描述如下，本領域技術人員將容易地明白將其改進，特別知道與糖肽抗生素一起使用的治療方案并將能夠適當地修改它們。例如，可以容易地使用簡單的劑量-反應試驗，在哺乳動物模型如小鼠類模型中的治療結果可以簡單地外推到人。
參考附圖，本發明將變得更為清楚，它們作為例子僅顯示了金黃色葡萄球菌感染的治療形式。


圖1顯示高劑量Aurograb的藥代動力學。X軸是以分鐘為單位的時間。Y軸是Aurograb在血樣中的μg/ml。
實驗下面詳述的實驗顯示，Aurograb(即SEQ ID NOs1和2)，本發明的特異抗GrfA的人重組抗體片段具有內在的體外和葡萄球菌感染鼠中抗葡萄球菌的活性，它顯示與糖肽抗生素的協同活性，特別是廣譜糖肽抗生素萬古霉素。
與糖肽抗生素的協同活性表現為(1)在體外存在Aurograb情況下，萬古霉素的最低抑制濃度減小和(2)用金黃色葡萄球菌激發后，單劑量Aurograb(2mg/kg)與單劑量萬古霉素(6mg/kg)聯合給藥，金黃色葡萄球菌感染鼠類模型中的器官集落計數減少。
除非另有說明，這里詳述的所有步驟采用標準方案按照可應用的廠商使用說明書進行。各種技術的標準方案包括PCR、分子克隆、操作和測序、抗體制備、抗原決定簇繪圖和模擬型設計、細胞培養和噬菌體顯示，描述于下列講義，如McPherson，M.J.等人(1991，PCR實用方法，Oxford University Press，Oxford)，Sambrook，J.等人(1989，分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbour Laboratory，New York)，Huynh和Davies(1985，″DNA克隆第I卷——實用方法″，IRL Press，Oxford，D.M.Glover主編)，Sanger，F.等人(1977，PNAS USA 74(12)5463-5467)，Harlow，E.和Lane，D.(″應用抗體實驗室手冊″，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，1998)，Jung，G.和Beck-Sickinger，A.G.(1992，Angew.Chem.Int.Ed.Eng.，31367-486)，Harris，M.A.和Rae，I.F.(″細胞培養一般技術″，1997，Cambridge University Press，ISBN 0521 573645)，″肽類和蛋白類的噬菌體顯示實驗室手冊″(Kay，B.K.，Winter，J.和McCafferty，J.主編，Academic Press Inc.，1996，ISBN0-12-402380-0)。
其中，這里細述方法使用的試劑和設備可從這些公司獲得Amersham(www.amersham.co.uk)，Boehringer Mannheim(www.boehringer-ingeltheim.com)，Clontech(www.clontech.com)，Genosys(www.genosys.com)，Millipore(www.millipore.com)，Novagen(www.novagen.com)，Perkin Elmer(www.perkinelmer.com)，Pharmacia(www.pharmacia.com)，Promega(www.promega.com)，Qiagen(www.qiagen.com)，Sigma(www.sigma-aldrich.com)和Stratagene(www.stratagene.com)。
在公開物指定的″PMID″參考號碼處，美國國家醫學圖書館給它們分配了PubMed標識號，從中在www.ncbi.nlm.nih.gov.上可以獲得每一個出版物的完整文獻目錄信息和摘要。這也提供了獲得完整公開物電子拷貝的直接方式，特別是在如PNAS、JBC和MBC公開物的情況下。
這里討論的每一個文獻的內容，包括這里引用的文獻，均在此整體合并為參考文獻。
1.人體研究為此研究，Aurograb與萬古霉素聯合給藥以降低培養證實的深層MRSA感染患者的死亡率和/或發病率。此研究分三部分進行i)耐受性和劑量范圍研究，3個MRSA感染患者組給予分段逐步升高劑量的Aurograb，開始于亞治療劑量(0.1mg/kg)，升至1mg/kg b.d.，在此過程中，仔細監測每一個患者的任何有害副作用。
ii)中期的、開放、標記研究，其中5個MRSA感染患者被給予預先的Aurograb治療過程，即1mg/kg b.d.7天，仔細監測耐受性和藥代動力學。根據歷史對照可以進行初步的有效性評價。
iii)前瞻性的、雙盲、隨機化II期試驗。
2.物理、化學和藥學特性表1
3.制劑、組合物、處理和儲存3.1制劑和組合物Aurograb的完整組合物在下面的表2中給出。它由每小瓶10mg的凍干(冷凍干燥的)粉末組成。靜脈注射前不久，在5mL消毒的可注射水中重懸浮粉末而給藥。不應使用其它的溶劑取代水，因為Aurograb對pH波動敏感并被特別地重懸浮在水中進行配制。
表2
存在L-精氨酸和尿素以維持制劑的pH平衡并保證Aurograb的溶解度。兩者存在的劑量被認為對臨床靜脈內給藥是安全的。例如，單劑量Aurograb(75Kg體重的患者37.5mL)含7.5mmoles精氨酸。這比兒童測量生長激素水平過程中給予的L-精氨酸最大允許每日劑量(ABPI綱要，1998-99)低26倍。對于尿素，35mL單劑量的Aurograb含1.125g尿素。這又更低于尿素的150g最大允許每日劑量(這是經靜脈內輸送治療急性顱內壓需要的最大劑量——ABPI綱要，1998-99)。
3.2儲存凍干藥物在玻璃小瓶中4℃暗處儲存。在環境溫度下過夜運輸是可接受的。避免長期暴露于明亮光線或過度潮濕。已經觀察到4℃(3個月)儲存后不改變Aurograb活性。
用水重制后，Aurograb必須儲存在4℃并應在14小時內使用。如果置于室溫，活性將緩慢損失。
3.3制備和給藥每小瓶10mg提供的Aurograb，于靜脈注射前不久，在5mL消毒的可注射水中重懸浮粉末給藥。人劑量的實例是1mg/kg b.d.。消毒水用皮下注射器/針經橡皮帽直接注射進入小瓶。
為重制添加終容積一半的水(2.5ml每小瓶)并混旋以溶解過濾(如必要)以去除任何未溶解的物質添加剩余的水NB.如果延遲給藥，儲存在4℃(最長至14小時)。
不應用其它溶劑取代水，因為Aurograb對pH波動敏感并已被特別地配方以在水中重懸浮。
Aurograb應當通過緩慢靜脈內彈丸注射給藥，例如通過靜脈內給藥裝置，它應當首先用鹽水沖洗以去除任何其它靜脈內液體的痕跡，然后在用藥后再次沖洗。
不需要特殊的預防措施來清除溢液或廢物處置。
靜脈用鹽水與重制的Aurograb是可配伍的(以50∶50稀釋)。它與20％葡萄糖和重碳酸鈉緩沖液很少配伍使用，如ELISA活性下降所顯示，因此如果要經過與這些或其它液體同一個靜脈給藥裝置給藥，注射端口必須在給予Aurograb前后用鹽水沖洗。
4.非臨床研究Aurograb在體外和體內都顯示對廣譜金黃色葡萄球菌菌株的抗菌活性。此外，Aurograb已顯示與萬古霉素聯合使用時發揮協同的抗菌作用。
4.1非臨床有效性研究體外資料Aurograb與萬古霉素聯合顯示抗寬范圍MRSA菌株的協同活性，包括對萬古霉素中度耐受的EMRSA菌株(″VISA″-萬古霉素不敏感MRSA)。
用相同的MIC方法學常規地應用到抗生素來準備這些資料。
目的證明與萬古霉素聯合對寬范圍MRSA流行菌株的協同作用。
觀察指標通過Aurograb聯合應用時，萬古霉素MIC的下降證明協同作用。
引言通過在萬古霉素濃度逐步升高的營養肉湯中連續傳代，引入的MRSA流行菌株容易地產生對萬古霉素中度耐受(即MIC 4或8μg/ml)的亞群(Burnie J等人，Clin Infect Dis.2000 Sep；31(3)684-9；PMID11017816)。這可能是許多與萬古霉素有關的治療失敗的原因。在此研究中，檢驗了Aurograb抗這些VISA和完全萬古霉素敏感親代EMRSA-15菌株的活性。
方法MRSA菌株在營養肉湯中過夜生長，并稀釋至1×103細胞/mL的接種體。100μl等份的培養物置于平底的微量滴定板，并加入0.125-250μg/ml的萬古霉素。培養物進一步孵育2天。最低生長抑制濃度(MIC)定義為沒有細菌生長發生的最高抗生素濃度，并通過分光光度法評價培養物中濁度(生長)缺失來測定。MICs在存在外源Aurograb或Aurograb制劑緩沖液(陰性對照)的情況下被測定。
結果(表3)
活性譜在所有檢測的菌株中抗菌活性增加是明顯的，表明抗MRSA菌株的廣譜活性。
協同作用Aurograb具有提高MRSA對萬古霉素敏感性的能力，包括對萬古霉素敏感性下降的MRSA。
為測定萬古霉素對若干MRSA菌株的MIC及Aurograb抗體對MIC的影響，進行了另外的實驗。還用氟氯青霉素代替萬古霉素進行了實驗，以研究Aurograb如何影響青霉素型抗體的有效性。結果在表3a中給出
用氟氯青霉素獲得的結果顯示，所有EMRSA菌株獲得的MIC＞256μg/ml。氟氯青霉素+Aurograb得到相同的結果并顯示氟氯青霉素MIC沒有減小。
結論Aurograb與萬古霉素聯合使用應當提高治療有效性并阻止出現萬古霉素耐藥菌株。就靶分子而言，由于抗體的結構和功能，可以預期使用其它的糖肽抗生素如替考拉寧可以獲得相似的結果，金黃色葡萄球菌對其采用的耐受機制與對萬古霉素相同，因此也是抗體的靶標并對其治療敏感。
4.2非臨床有效性研究體內資料葡萄球菌感染的鼠類模型被廣泛使用，并常規地用于抗菌藥物的評價。這是被感染的人體內有效性的很好預測器，因為金黃色葡萄球菌經靜脈內引入產生菌血癥，由此病原體播散至其它器官，包括腎、肝和脾。因此，感染(敗血癥)的狀態類似于在感染患者中的情況。而且，動物模型中所用的Aurograb靜脈內給藥途徑(下面給出的資料)與通常在患者中使用的途徑相同，提高了藥代動力學、藥物生物利用度和有效性可比較的可能性。
資料系1Aurograb內在的抗EMRSA-15抗菌活性目標證明單獨給予Aurograb對感染萬古霉素敏感的MRSA菌株EMRSA-15的小鼠是有療效的。
目的有Aurograb情況下，通過死亡率的下降或腎、肝或脾中細菌含量(集落形成單位)的減少來顯示抗葡萄球菌活性。
方法20只雌性CD-1小鼠給予亞致死激發量(1.3×107cfu)的耐甲氧西林、萬古霉素敏感株金黃色葡萄球菌(EMRSA-15，TypedHospital Isolate，Central Manchester Healthcare Trust)100μl，彈丸靜注(所有靜脈注射都通過尾靜脈進行)。1小時以后，兩組10只的小鼠接受以下的100μl靜脈彈丸注射-
1.緩沖液制劑(精氨酸-尿素)，作為陰性對照，或2.Aurograb(2.0mg/kg)的緩沖液制劑。
繼續48小時，處死所有動物，確定每克器官的活性cfu后。
結果(表4)
結論抗細菌活性—采用在腎中選擇性定位，在腎，肝和脾中發現了有活力的葡萄球菌。使用Aurograb可導致所有三種器官中發現的活生物體對數(10倍)性減少。這表明使用鼠的深層感染模型，在不使用任何其他的外源性抗微生物物質的情況下，Aurograb可減少鼠實驗性感染中金黃色葡萄球菌的活力。
資料系2Aurograb劑量范圍研究目標使用Aurograb對抗金黃色葡萄球菌EMRSA-15株的劑量范圍研究。
目的當Aurograb以單一藥劑給藥，與安慰劑對照組相比，可更大幅度的減少腎，肝或脾中的細菌含量(器官cfu)，證明了其抗菌活性。通過在不同劑量下不同器官中比較cfu(表示為每克組織中的cfu對數)來確定劑量范圍。
方法40只雌性CD-1小鼠(24-26g)靜脈彈丸注射金黃色葡萄球菌進行激發，2小時后，靜脈給予單獨給予安慰劑或Aurograb(2mg/kg，1mg/kg或20mg/kg)。在48小時處死所有小鼠，培養腎，肝和脾以確定器官活力計數。
結果表示為每克組織的對數cfu實驗1金黃色葡萄球菌(1.5×107cfu)EMRSA-15(表5)
實驗2金黃色葡萄球菌(9×106cfu)臨床分離EMRSA-15-低劑量Aurograb(表6)
1對GrfA的非保護性抗原決定簇特異的陰性對照抗體(WC7)。
實驗1在1.0至2.0mg/kg Aurograb的范圍內，對肝和脾可達到活細菌減少10至100倍。在0.2mg/kg Aurograb時，從脾中的清除率仍然是良好的，但在肝是減小的。最高的劑量可引起腎細菌計數0.8的對數性減少，但較低劑量時不減少。
實驗2在0.2mg較低的劑量下很明顯在腎中活葡萄球菌沒有減少，但在肝和脾中有殺死細菌的證據。
結論使用2mg/kg的Aurograb可使在所有三種器官中發現的活生物體減少，但特別是脾和肝。1mg/kg劑量的Aurograb也顯示在脾和肝中明顯的抗菌活性，但在腎中活性喪失。在0.2mg/kg的較低劑量下，仍在脾中顯示抗菌活性，在肝中低一些。
對人使用的推算小鼠2.0mg/kg的單一劑量在肝和脾的計數中產生大約2.0對數下降，在腎計數中產生0.8的對數下降。以體重為基礎，對于人這相當于1mg/kg，每天2次。
資料系3Aurograb的抗菌活性和與萬古霉素的協同作用亞致死模型。
目標為了證明對于用亞致死劑量的金黃色葡萄球菌感染的小鼠，在單獨給藥時Aurograb具有抗菌性，當與萬古霉素聯合給藥時具有協同作用。
目的通過單獨使用Aurograb，在腎，肝或脾中的細菌含量(集落形成單位)減少而證明其抗菌活性。當Aurograb和萬古霉素一起給藥時器官集落計數較兩種抗菌劑單獨給藥時的計數大幅度降低，從而證明其協同作用。
方法60只雌性CD-1小鼠(22-24g)以100μl彈丸靜脈注射給予1×107cfu EMRSA-15。2小時后，每組10只小鼠，接受單一100μl彈丸靜脈注射1組-6.0mg/kg萬古霉素+2.0mg/kg Aurograb2組-6.0mg/kg萬古霉素+0.2mg/kg Aurograb3組-6.0mg/kg萬古霉素+安慰劑(制劑緩沖液)4組-安慰劑+2.0mg/kg Aurograb5組-安慰劑+0.2mg/kg Aurograb6組-安慰劑+2.0mg/kg Aurograb所有小鼠在48小時處死，培養腎，肝和脾。
結果表示為每克組織的對數cfu，除非在大多數小鼠(＞5)中被清除(即器官培養陰性)。N/A＝不適用的。(表7)
單獨使用Aurograb以2.0mg/kg(4組)單獨應用與單獨使用萬古霉素(3組)產生可相比較的結果，每個分別可清除8只小鼠的肝，4只和5只小鼠的脾，相比陰性對照組(6組)只有1只小鼠可清除肝和脾。腎清除率萬古霉素優于Aurograb，盡管沒有1只小鼠可清除腎臟感染。
協同應用的小鼠(1組)接受2.0mg/kg Aurograb和萬古霉素(6mg/kg)，顯示所有10只小鼠從肝中完全清除葡萄球菌，從脾中的清除率增加，9只小鼠培養陰性，相比單獨使用Aurograb或萬古霉素清除4-5只，未處理組1只清除。接受聯合治療(1組)的腎集落計數與單獨接受萬古霉素的小鼠(3組)相比另外減少了0.5對數，與陰性對照小鼠(6組)相比減少了1.6對數。這證明了在Aurograb和萬古霉素之間存在協同作用。
資料系4Aurograb與萬古霉素的協同致死性模型。
目標證明對用致死劑量的金黃色葡萄球菌感染的小鼠，當單獨給藥時Aurograb是有抗菌性的，當與萬古霉素聯合應用時是有協同性的。
目的通過單獨使用Aurograb，死亡率降低而證明其抗菌活性。當Aurograb和萬古霉素一起給藥，而不是單獨給予萬古霉素時，死亡率大幅度降低，從而證明其協同作用。
方法60只雌性CD-1小鼠(22-24g)以100μl彈丸靜脈注射給予8×107cfu劑量的金黃色葡萄球菌(EMRSA-15的新鮮臨床分離物)。2小時后，每組10只小鼠，接受單一100μl彈丸靜脈注射1組-4.0mg/kg萬古霉素+2.0mg/kg Aurograb2組-4.0mg/kg萬古霉素3組-2.0mg/kg萬古霉素+2.0mg/kg Aurograb4組-2.0mg/kg萬古霉素5組-2.0mg/kg Aurograb6組-安慰劑所有小鼠在48小時處死，培養腎、肝和脾。
在48小時采集前死亡的小鼠不進行器官集落計數。
結果表示為每克組織的對數cfu，除非大多數小鼠(＞5)死亡(表8)。
死亡率這株金黃色葡萄球菌，可能因為是新鮮的臨床分離物，在鼠模型中較以前使用的實驗室EMRSA-15菌株的毒力更強，觀察到很高的死亡率。與未處理組(7只死亡)相比，單獨給予Aurograb(2.0mg/kg)可使死亡率下降(4只死亡)，與單獨使用萬古霉素(6和5只死亡)是可比較的。這表明在4.0mg/kg時Aurograb具有與萬古霉素相當的固有的抗葡萄球菌活性。
協同作用接受聯合治療(Aurograb 2.0mg/kg和萬古霉素4.0mg/kg)的小鼠較單獨使用萬古霉素或Aurograb有更高的生存率，表明兩種藥物有協同效應。
5.在動物中的藥物動力學和產物代謝5.1藥物動力學Aurograb的藥物動力學(PK)參數已經在小鼠中進行了研究。使用鼠模型是因為已經在這種種屬中進行了效應和劑量范圍的研究，以及反復的劑量毒理學研究。小鼠以靜脈彈丸的形式給予單一的最高劑量，然后重復檢測血液水平和器官分布。對尿標本也進行了分析。分析標本的功能活性，用ELISA測定(僅對血標本)，測定藥物濃度(SDS PAGE/免疫印跡)。
結果結果在圖1中顯示。給予單一靜脈彈丸注射Aurograb(10mg/kg)的小鼠顯示了滿意的血液水平。
所有器官(肺，腦，肝，脾，心，腎和血液)通過24小時可被清除。
6.2血液相容性研究本研究由蘇格蘭Inveresk Research的生化藥物學系完成，其目的是評價Aurograb靜脈應用的適應性。
從健康人志愿者中采集血標本，轉移至含有Aurograb，Aurograb載體，皂甙或鹽水的試管中，并在37℃孵育1小時。離心后，確定上清液中血紅蛋白的量以測定溶血作用。根據美國試驗和材料協會分類系統(ASTM F756-93，1993)數據表明0.1mg/ml Aurograb和Aurograb載體是非溶血性的。這可與無血溶性的生理鹽水相比較，總體上與陽性參考化合物(皂甙)是對比的，后者發現是具有嚴重的溶血性的。
7生產Aurograb抗體7.1介紹Aurograb以包含體的形式在大腸桿菌中產生。包含體的分離，溶解，變性和重折疊以前已經被詳細敘述(見“抗體實驗室手冊”。Harlow，E.和Lane，D.1988。Cold Spring Harbor Laboratory Press；“包含體和蛋白以生物學活性形式的純化”。Mukhopadhyay，A.1997.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.；5661-109)。這樣一種步驟的實例概述在本應用中。簡言之，從細胞團中提取包含體，溶解/變性，重折疊和使用層析純化。用強的T7啟動子從載體pET29b(Novagen)中過度表達Aurograb。作為質量控制的，在無菌發酵罐(1000L)中制備的純培養物，使用不含動物產物的培養基產生細胞團。使用的大腸桿菌株是遺傳缺陷的(不能在環境中定植/)和無毒力的。在下游處理過程中去掉的雜質是(1)大腸桿菌細胞蛋白(HCPs)(2)大腸桿菌致熱原(主要是內毒素)(3)發酵添加劑(抗生素)(4)下游處理添加劑(緩沖液和NiSO4)。
來自大腸桿菌的大量污染物和實質上所有發酵培養基來源的污染物可在從包含體中提取蛋白的過程中被去掉。為此，通過離心分離細胞團，采用微型fluidiser進行破碎。Aurograb包含體從細胞團中通過三個離心-重懸浮-微流體化作用步驟分離出來，因此要大量的沖洗包含體。包含體被溶解和重折疊，經過2天的時間，在氧化催化劑氯化銅的存在下，形成了正確的和生物學活性結構的Aurograb分子。進行廣譜透濾作用以從重折疊反應中去除小分子和痕量的殘余卡那霉素(從發酵反應中)。剩余的宿主細胞蛋白通過固定的鎳-金屬親合層析(IMAC)和陰離子交換被去除。特別是，對于從大腸桿菌中制備的藥物有顯著的安全性問題的內毒素，可有效地在IMAC的過程中通過添加脫氧膽酸而被去除。最后的痕量大腸桿菌HCP在陰離子步驟中被去掉。IMAC步驟中的痕量鎳可采用鎳親合柱去掉。最終層析緩沖系統中的小分子可再次使用透濾作用從制劑緩沖液中去除。大量產物凍干在小瓶中以用于患者。下面編號的段落將特別地詳細描述Aurograb抗體的生產過程。
7.2 Aurograb生產過程發酵和下游的處理采用下面總共九個步驟1.發酵2.收獲和分離包含體3.重折疊4.濃縮和透濾
5.過濾和無菌過濾6.純化-固定鎳(Ni2+)金屬親合層析(IMAC)7.純化-通過螯合的瓊脂糖層析去掉鎳8.純化-陰離子交換層析9.透濾和大量充填7.3發酵凍存的表達Aurograb的大腸桿菌(CloneJM109(DE3)(pSaABC4))儲存液接種至4×500ml玻璃錐形瓶中，在轉移至1000L攪拌發酵罐(MBR)之前制備接種物。預培養物(添加卡那霉素)在37℃孵育，振搖15-20小時，直至預培養物OD578＝4.0-8.0，代表7-8次細胞分裂。在生產的規模時，預培養物轉移至含有1000L營養肉湯的1000L發酵罐(MBH)中。產生的培養物在37℃孵育總共14-18小時，代表7次細胞分裂。接種后大約10-13小時，當OD578＝5-8，產生的培養物通過添加23.8g IPTG(100μM)而被誘導。
7.4收獲和分離包含體細胞通過離心收獲(誘導后4h)，Alfa Laval BTPX 205離心機，12,800g，流率大約為400L/h。收獲的大腸桿菌細胞團在-50℃儲存在PE袋中(Kendro)。來自單批發酵的已經儲存在-50℃的100％細胞團的下游處理形成了一次純化過程。細胞團復溫，重新懸浮在1000L溶解緩沖液中。重懸浮的細菌細胞進行高壓均化作用(APV Gaulin MC15)，ca.1000巴(15,000psi)，流率ca.500L/h。通過離心沉淀包含體，ca.12.800g，流率ca.400L/h。然后用400L溶解緩沖液沖洗包含體，離心沉淀，ca.12.800g，流率ca.400L/h，總共三次。沖洗的包含體在重折疊步驟前以混懸液儲存在-70℃。包含體通過強烈的攪拌5-10分鐘在40L 6M尿素/100mM Tris pH12.5中室溫下溶解。
7.5重折疊為了重折疊包含體溶液用重折疊緩沖液制成560L，加入CuCl2.2H2O至終濃度100μM。配制液在強烈的攪拌下在2-8℃孵育48小時。包含體被過濾(Sartorius GF 30″，3.0/0.8μrn)，然后濾器滅菌(SeitzSupradisc SDPEK 1，depth filter)。
7.6濃縮和透濾采用截取10kDa(Pall)的Ω篩選通道盒(15m2)進行濃縮和透濾步驟，該通道固定在”Centrasette”不銹鋼架(Pall)上，受一個1000膜片活塞泵(quattro泵)的控制。重折疊的蛋白制劑濃縮至150L，然后用3000升10mM醋酸銨緩沖液，pH9.5進行透濾。制劑調整至6M尿素，50mM Tris，10mM DCA，1M NaCl，用RO水制成最終體積為300L。透濾的重折疊液在2-8℃儲存過夜。然后通過添加HCl將pH調整至8.0。
7.7過濾步驟和無菌過濾透濾的重折疊液被過濾(Seitz SupradiscSDPEK1，depth filter)，然后濾器滅菌(微孔過濾器Opticap 10″，0.2μm)。無菌產物儲存在2-8℃。
7.8固定Ni2+金屬親合層析(IMAC)IMAC步驟在BPG300/500柱(Amersham Pharmacia)中進行。層析柱的滅菌發生在樹脂定置洗凈(CIP)的過程中。IMAC層析樹脂(18L)最初用2柱體積的(CV)100mM NiSO4.6H2O填充。層析使用5.5(CV)平衡緩沖液(IMAC A)；5.5CV沖洗緩沖液I(IMAC B)；3.3CV沖洗緩沖液II(IMAC C)；5.5CV洗脫緩沖液(IMAC D)。從洗脫液收集的餾分用濾器滅菌(微孔過濾器Opticap10″，0.2μm)，并在2-8℃儲存過夜。
7.9鎳清除層析鎳清除層析是在BPG140/500柱(Amersham Pharmacia)中進行，使用2L螯合瓊脂糖樹脂。用5CV緩沖液(IMAC D)平衡和沖洗柱，應用含有Aurograb抗體的溶液，用2CV陰離子/調節緩沖液(50mM Tris，6M尿素pH8.7)沖洗柱，在陰離子交換層析之前保留洗脫液。
7.10陰離子交換層析陰離子交換層析是在BPG300/500柱(Amersham Pharmacia)中進行，使用18L樹脂(Q-Sepharose FF)。柱用平衡緩沖液平衡，然后用陰離子/調節緩沖液平衡。使用含有Aurograb抗體的溶液，用2CV陰離子/調節緩沖液沖洗，流過的液體濾器滅菌(微孔過濾器Opticap10″，0.2μm)，2-8℃儲存過夜。
7.11透濾和大量充填無菌流出液(含有Aurograb抗體)的pH調整至9.5，然后在10次循環體積(TOV)的10mM醋酸銨；0.5M尿素，pH9.5中進行透濾。然后進行另一次透濾步驟，在5次TOV 0.5M尿素，0.2M精氨酸pH9.5中透濾。蛋白濃縮至2mg/ml，過濾滅菌(微孔過濾器Opticap10″，0.2μm)進入Stedim袋，在2-8℃儲存。
7.12緩沖液成分，培養基和溶液生長培養基在接種前監測培養基的微生物污染。
對于2.5L預培養物大豆蛋白胨A3(Organotechnie) 67.5g酵母自溶產物(KAV；Deutsche Hefewerke) 35.0g氯化鈉(Ph.Eur，E.Merck) 12.5g甘油(Ph.Eur，E.Merck) 75.0g磷酸氫二鉀(Ph.Eur，E.Merck) 11.5g磷酸二氫鉀(Ph.Eur，E.Merck) 7.5g7水硫酸鎂(Ph.Eur，E.Merck) 1.25g卡那霉素硫酸鹽(Sigma) 62.5mgRO I水 2.5升pH 7.1±0.1上表中的物質預先稱重，溶解在2.5L RO 1水中。肉湯滅菌后，加入卡那霉素硫酸鹽10ml(62.5mg在50ml WFI中)。
1000L培養物的成分大豆蛋白胨(Organotechnie) 27.0kg酵母自溶產物(KAV；Deutsche Hefewerke) 14.0kg氯化鈉(Ph.Eur，E.Merck) 5.0kg甘油(Ph.Eur，E.Merck) 30.0kg磷酸氫二鈉(Ph.Eur，E.Merck) 4.6kg磷酸二氫鈉(Ph.Eur，E.Merck) 3.0kg7水硫酸鎂(Ph.Eur，E.Merck) 0.5kgStruktol(消泡劑，Sichler) 600ml
卡那霉素硫酸鹽(USP，Sigma)25.0gRO I水1000升pH7.0±0.21000 L發酵罐在121℃滅菌30分鐘。
IPTG23.8g IPTG(Sigma)溶解在200ml WFI中，無菌過濾(0.2nom)。
細胞溶解緩沖液Tris(Ph.Eur，E.Merck) 6.06gL-1EDTA(Ph.Eur，E.Merck) 0.37gL-1氯化鉀(DAB，E.Merck)7.46gL-1RO I水 1000升pH 8.0±0.1重折疊緩沖液Tris(DAB，E.Merck) 5.96gL-1氯化銅(p.a.，E.Merck) 0.018gL-1RO I水(1000 L不銹鋼容器)600升pH 9.0±0.1透濾緩沖液醋酸銨(E.Merck) 0.77gL-1RO I水 1000升pH 9.0±0.1IMAC緩沖液標本的制備Tris1.82kg尿素108kg
氯化鈉17.5kg脫氧膽酸，鈉鹽1.30kg150L透濾的重折疊反應的成分用上述試劑進行調整。
IMAC層析緩沖液鎳溶液100mM NiSO4.6H2O(2CV)IMACA/平衡緩沖液100mM Tris；6M尿素；1MNaCl；10mM DCA，pH8.0IMAC B/沖洗緩沖液100mM Tris；6 M尿素；1M NaCl；50mM咪唑；10mM DCA，pH8.0IMAC C/洗脫緩沖液I100mM Tris；6M尿素；1M NaCI；150mM咪唑；pH8.0(10-15CV)IMAC D/洗脫緩沖液II100mM Tris；6M尿素；1M NaCl；300mM咪唑pH8.0(7CV)CIP1M NaOH(3柱體積，孵育時間1小時)緩沖液用Tris(USP，E.Merck)，尿素(USP，E.Merck或Riedelde Haen)，NaCl(Ph.Eur，E.Merck)，咪唑(p.a.，Fluka)，DCA(脫氧膽酸，鈉鹽一水化物，Microselect，Fluka)，NiSO4.6H2O(p.a.，E.Merck)制備。
Ni2+清除層析緩沖液平衡緩沖液100mM Tris；6M尿素；50mM NaCl；300mM咪唑；pH8.0(5CV)陰離子交換層析緩沖液平衡液100mM Tris；6M尿素；50mM NaCl；300mM咪唑pH8.7CIP1M NaOH(3CV，孵育時間1小時)透濾和制劑緩沖液為了滅菌和儲存，透濾盒用RO水沖洗，用0.5M NaOH至少再循環45分鐘，用0.1M NaOH儲存。
透濾緩沖液0.5M尿素；10mM醋酸銨pH9.5透濾(制劑)緩沖液0.5M尿素；0.2M精氨酸pH9.5
透濾和濃縮(2盒，Ω篩選通道，10 KD，Pall)8.確定Aurograb和萬古霉素的協同效應8.1方法為了確定最低抑制濃度(MIC)，部分抑制濃度(FIC)和FIX(部分抑制指數)，使用方法如下。
每種最普通的EMRSA株的代表，許多萬古霉素抗性亞群，和三種Linzolid抗性菌株在營養肉湯中生長過夜。細胞在IsosensitestBroth(Oxoid，UK)稀釋至最終每mL接種1×103細胞。100μl等分培養物置于平底的微量滴定板中，加入的萬古霉素的范圍是0.125-250μg/ml。以棋盤格方式在其中加入0.3-25μg/ml范圍的外源Aurograb。也制備僅含有Aurograb制劑緩沖液的陰性對照系列。培養物在37℃孵育48小時。
最低抑制濃度(MIC)定義為沒有細菌生長發生時試劑的最低濃度，通過分光光度計對培養系統中無濁度(生長)時的評定而測定。這種視覺上的透明相當于99％以上的葡萄球菌死亡。
8.2結果獲得萬古霉素和Aurograb(RTM)單獨和聯合使用的MIC值。計算部分抑制濃度(FIC)和FIX。
兩種藥劑之間的協同活性確定為FIX值≤0.5。0.5-4的值確定為不同的活性，值為≥4確定為拮抗作用。
在下面的表9和10中給出了實驗的結果。VAN代表萬古霉素。
MIC(單獨)柱表示當單獨給藥時的最低抑制濃度。MIC(聯合)柱表示當聯合使用時的最低抑制濃度。
8.3結論如在表9和10中所見，萬古霉素與Aurograb一起給藥可協同的引起要達到的治療效應，其MIC水平大體上是降低的，反過來表明患者的治療可使用更低劑量的抗生素，達到更高的治療效應，預期能減少抗生素可能導致的副作用。結果表明即使在由萬古霉素抗性的金黃色葡萄球菌感染的患者，可成功的用本發明的抗體進行治療，其與如萬古霉素的抗生素聯合使用，在以前無效的、無毒性的抗生素劑量水平下，可達到有效的治療。
表9
表10
序 列 表<110>神經技術藥物公司<120>微生物感染的治療<130>N01/0697/PCT<150>GB 0127983.5<151>2001-11-22<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>795<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人單鏈(scFv)重組抗體<220>
<221>CDS<222>(1)..(792)<223>
<400>1atg gcc aag gtg cag ctg ttg cag tct gca act gag gtg aag aag cct 48Met Ala Lys Val Gln Leu Leu Gln Ser Ala Thr Glu Val Lys Lys Pro1 5 10 15ggg gcc tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tat ggt tac act ttc acc 96Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Tyr Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30gat tat ggt ata acc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag144Asp Tyr Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu35 40 45tgg atg gga tgg atc age gct tat aat ggt tac aca aac tat gcg cag192Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln50 55 60
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<223>人單鏈(scFv)重組抗體<400>2Met Ala Lys Val Gln Leu Leu Gln Ser Ala Thr Glu Val Lys Lys Pro1 5 10 15Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Tyr Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30Asp Tyr Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu35 40 45Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Thr Ash Tyr Ala Gln50 55 60Lys Phe Gln Asp Arg Ile Thr Met Thr Thr Asp Ala Ser Thr Ser Thr65 70 75 80Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Leu85 90 95Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Glu Asp Ala Ser Leu Leu Arg Asp Gly His100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu130 135 140
Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu145 150 155 160Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Set Ser Tyr165 170 175Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile180 185 190Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly195 200 205Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Lys Leu Glu Pro210 215 220Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Ser Ser Pro225 230 235 240Trp Thr Ser Arg Pro Arg Asp Gln Ser Asp Ile Lys Arg Ala Ala Ala245 250 255Leu Glu His His His His His His260<210>3<211>7<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌<400>3Gly Val Thr Thr Ser Leu Ser1 權利要求
1.一種具有SEQ ID NO2序列的抗體或其抗原結合片段。
2.一種具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的肽所顯示的對抗原決定簇特異的抗體，用于治療或診斷人體或動物體的方法。
3.具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的肽所顯示的對抗原決定簇特異的抗體在制備治療感染的藥物的方法中的用途。
4.一種含有治療有效量的糖肽抗生素和GrfA特異抗體的藥物。
5.根據權利要求4用于治療或診斷人體或動物體的藥物。
6.根據權利要求4的藥物治療革蘭氏陽性細菌感染。
7.制備治療感染的藥物的方法，其特征在于使用治療有效量的糖肽抗生素和GrfA特異抗體。
8.一種治療感染的藥物包裝，包括治療有效量的糖肽抗生素和GrfA特異抗體。
9.一種治療感染的方法，其步驟包括給予需要的患者以治療有效量的糖肽抗生素和GfrA特異抗體。
10.根據權利要求4和7-9中任何一項中的藥物、制備方法、藥物包裝或治療方法，其中所述的抗體具有SEQ ID NO2的序列。
11.根據權利要求4和7-10中任何一項中的藥物、制備方法、藥物包裝或治療方法，其中所述的抗體對SEQ ID NO3的抗原決定簇是特異的。
12.根據權利要求4和7-11中任何一項中的藥物、制備方法、藥物包裝或治療方法，其中所述的糖肽抗生素選自萬古霉素、替考拉寧和達托霉素。
13.根據權利要求4和7-12中任何一項中的藥物、制備方法、藥物包裝或治療方法，其中所述的感染是革蘭氏陽性細菌感染。
14.根據權利要求13中的藥物、制備方法、藥物包裝或治療方法，其中所述的細菌是葡萄球菌。
15.根據權利要求14中的藥物、制備方法、藥物包裝或治療方法，其中所述的細菌是凝固酶陰性的葡萄球菌。
16.根據權利要求15中的藥物、制備方法、藥物包裝或治療方法，其中所述的葡萄球菌選自溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌。
17.根據權利要求14中的藥物、制備方法、藥物包裝或治療方法，其中所述的細菌是凝固酶陽性的葡萄球菌。
18.根據權利要求17中的藥物、制備方法、藥物包裝或治療方法，其中所述的葡萄球菌是金黃色葡萄球菌。
19.根據權利要求13中的藥物、制備方法、藥物包裝或治療方法，其中所述的細菌選自腸球菌屬、糞腸球菌、屎腸球菌、棒狀桿菌屬、杰氏棒狀桿菌和干燥棒狀桿菌。
20.根據權利要求13中的藥物、制備方法、藥物包裝或治療方法，其中所述的細菌對單獨使用所述的糖肽抗生素是耐藥的。
全文摘要
本發明涉及新的抗體、藥物、藥物包裝、制備藥物的方法和治療微生物感染的方法，特別是治療葡萄球菌感染如金黃色葡萄球菌感染的方法，包括MRSA感染。
文檔編號A61P31/04GK1589280SQ02823178
公開日2005年3月2日 申請日期2002年11月13日 優先權日2001年11月22日
發明者J·P·伯尼, R·C·馬修斯 申請人:神經技術藥物公司