專利名稱：三種α型芋螺多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種α型芋螺多肽及其應用。
背景技術：
芋螺屬腹足綱軟體動物，全世界約有500余種，遍布世界各暖海區，我國有芋螺 100多種，主要分布在我國的西沙群島、海南島及臺灣海域。芋螺多肽是由芋螺毒液管和毒囊內壁的毒腺所分泌，每種芋螺的毒液中含50-200個活性多肽，不同品種芋螺所含的活性肽各不相同，即使同種芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差異，理論上估計約存在5萬多種不同活性的多肽(Mcintosh, J. Μ.，Jones, R. Μ. (2001). Cone venom-from accidental stings to deliberate injection. Toxicon,39,1447-1451. Nelson, L. (2004). Venomous snails :0ne slip, and you，re dead. Nature，429，798-799.)。芋螺多肽能特異性作用于乙酰膽堿等神經遞質的各種受體亞型，以及鈣、鈉和鉀等多種離子通道，不僅可以直接作為藥物，還可以作為理想的分子模型用于開發新藥的先導化合物。其中，ω型芋螺多肽MVIIA 已被FDA批準作為治療HIV和晚期癌癥痛的藥物進入市場；從中國南海線紋芋螺中發現的 S0-3 也具有很強的鎮痛活性(Dai qy et al. J Nat Prod 2003，66 (9) 1，276-9 ；專利 Zl 00128525. 4)。但上述兩種芋螺多肽作用于中樞神經的N-型鈣通道，給藥方式為鞘內，不方便使用。α -芋螺多肽(α -CTX)屬于芋螺多肽A超家族(按信號肽保守序列及二硫鍵排列模式芋螺多肽分為Α，Μ, 0，P，I，J，S，T等超家族)，特異作用于肌肉型及神經元型nAChRs。 絕大多數α-芋螺多肽含12-18個氨基酸、兩對二硫鍵(CCXmCXnC,連接方式為1_3，2_4)。 根據m，η的數目不同，α -芋螺多肽細分為α 3/5，α 4/3，α 4/4，α 4/6，α 4/7亞家族。目前發現某些α-芋螺多肽具有鎮痛活性，其中α-芋螺多肽vci. i(gccsdprcnydhpeiconh2) 是來自維多利亞芋螺(Conus Victoriae)，由16個氨基酸組成，含兩對二硫鍵(二硫鍵的排列方式為 1-3，2-4) (Sandall et al. Biochemistry2003，42，6904-6911.)。研究表明 Vcl. 1在神經性疼痛動物模型中表現出了較好的鎮痛活性并具有加速損傷神經恢復的作用 (Satkunanathan et al. Brain Res 2005，1059，149-158)，2006 年已進入臨床研究階段。另一種α型芋螺多肽RgIa在動物模型中同樣表現出鎮痛作用。由此可見，α型芋螺多肽中存在某些具有較好鎮痛活性的多肽，它們對于開發新一代神經性疼痛的治療藥物具有重要意義，而且這些多肽可以采用皮下、肌肉或腹腔等給藥方式，大大方便了應用。根據神經損傷的病因、性質和程度不同，在臨床上分為中樞神經疼痛和外周神經損傷所致的周圍神經疼痛兩大類。其中，中樞神經疼痛簡稱中樞痛，為中樞神經系統的疼痛傳導通路發生損害或功能障礙而引起的原發性疼痛，常見于脊髓的創傷、腦血管疾病或多發性硬化癥和腫瘤等。周圍神經疼痛系外傷、缺血、壓迫、感染、炎癥或代謝等因素損傷外周神經所致，如幻肢痛、帶狀皰疹后神經痛、多發性神經炎、糖尿病性周圍神經痛等。神經性疼痛的典型癥狀包括感覺異常、痛覺過敏和痛覺超敏等。臨床上常用的藥物主要有抗驚厥藥(如萊提西酞、奧卡西平)、阿片類藥(如嗎啡)和各種抗抑郁藥的聯用，但是由于毒副作用以及長期用藥帶來的耐受性、成癮性等問題，治療效果不佳(Dray et al, Br J Anaesth. 2008,101(1),48-58 ；Gilron et al, Expert Opin Emerg Drugs. 2007,12(1), 113-26.)。因此，發現新一代高活性、低耐受和非成癮的鎮痛藥物十分必要。

發明內容
本發明的目的是提供一種α型芋螺多肽及其應用。本發明提供的α型芋螺多肽為通式I所示的多肽；X^-Χ200Χβ—Χ4_-^-14^- ^通式 I通式I中&選自G、R中任意一個氨基酸或空缺；&選自G、N、K中任意一個氨基酸；&選自S、T、D、M中任意一個氨基酸；&選自N、R、I、F中任意一個氨基酸；&選自P、S、H中任意一個氨基酸；&選自A、F、D、T中任意一個氨基酸；X7選自M、K、Y、P、N中任意一個氨基酸；&選自L、R、N、I中任意一個氨基酸；X9選自K、I、D、Y中任意一個氨基酸；X10選自Y、N中任意一個氨基酸；X11選自P、R、S、K中任意一個氨基酸；)(12選自N、D、E、R、L中任意一個氨基酸；X13選自L、Q、F中任意一個氨基酸或空缺；X14選自N、Y中任意一個氨基酸或空缺；β選自酰胺基、或羧基；上述字母定義如下D_天冬氨酸；E-谷氨酸；I-異亮氨酸；K-賴氨酸；L-亮氨酸； M-蛋氨酸；N-天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S-絲氨酸；T-蘇氨酸；G-甘氨酸；F-苯丙氨酸；P-脯氨酸；H-組氨酸；A-丙氨酸；Y-酪氨酸。所述多肽具體可為如下七種多肽中的任意一種多肽I 氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽II 氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽III 氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽IV 氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽V 氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VI 氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VII 氨基酸序列如序列表的序列13所示。
7個多肽的氨基酸序列如下
多肽tlnh2-gccsnpacmlknpnlc-conh2 ；
多肽t2:nh2-ncctrsfckriypdlc-conh2 ；
多肽t3nh2-gccdipdcynknreqc-conh2 ；
多肽jmnh2-nccmfhtcpidysrfnc-conh2 ；
多肽t5nh2-gnccmfhtcpidysrfnc-conh2 ；
多肽t6nh2-gnccmfhtcpιdysrfyc-conh2 ；
多肽t7nh2-rkccsnpacnrynklc-cooh。
所述多肽ii的制備方法具體如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列8所示且最后一-位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調節pH
值為8. 2，磁力攪拌Μ-4 !，得到多肽II。所述多肽III的制備方法具體如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列9所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0. IM的 NH4HCO3緩沖液中，用氨水調節pH值為8. 2，磁力攪拌對-4他，得到多肽III。所述多肽IV 的制備方法具體如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列10所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調節pH值為8. 2，磁力攪拌 Μ-4 !，得到多肽IV。所述多肽V的制備方法具體如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列11所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中， 用氨水調節PH值為8. 2，磁力攪拌M-4 !，得到多肽V。所述多肽VI的制備方法具體如下 化學合成氨基酸序列如序列表的序列12所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽， 溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調節pH值為8. 2，磁力攪拌對-4他，得到多肽VI。 所述多肽I的制備方法具體如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列7所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，置于PH7. 70. IM Tris-HCl緩沖液中氧化^h，然后加入醋酸終止反應，脫鹽凍干，然后與IOmM碘溶液避光反應lOmin，得到多肽I。所述多肽VII的制備方法具體如下化學合成序列表的序列13所示的線性多肽，置于pH7. 70. IM Tris-HCl 緩沖液中氧化^h，然后加入醋酸終止反應，脫鹽凍干，然后與IOmM碘溶液避光反應lOmin， 得到多肽VII。所述多肽的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。所述多肽的編碼基因具體可為如下七種DNA片段中的任意一種(1)序列表的序列1自5’端第142至189位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2自5’端第142至189位核苷酸所示的DNA分子；(3)序列表的序列3自5’端第133至180位核苷酸所示的DNA分子；(4)序列表的序列4自5，端第139至189位核苷酸所示的DNA分子；(5)序列表的序列5自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(6)序列表的序列6自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(7)序列表的序列7自5’端第133至180位核苷酸所示的DNA分子。本發明還保護一種用于鎮痛的藥物，其活性成分為以上任一所述的多肽。以上任一所述的多肽在制備用于鎮痛的藥物中的應用也屬于本發明的保護范圍。本發明還保護一種鎮痛劑，為以上任一所述的多肽。以上任一所述的多肽或均可應用于制備鎮痛劑。
上述α型芋螺多肽可采用Fmoc法固相合成，用高效液相色譜技術純化。經過活性測定發現通式I的7個多肽具有鎮痛作用，其中α芋螺多肽T_l、Τ_2、 Τ-3、Τ-4具有顯著的鎮痛活性，Τ5-Τ7也有明顯鎮痛活性，在抑制鎮痛方面具有應用價值。所述的α型芋螺多肽的衍生物也屬于本發明的保護范圍。所述的α型芋螺多肽的衍生物可為如下(I)、(II)、(III)或(IV)(I)將所述α型芋螺多肽進行一個或多個氨基酸的插入和/或替換和/或缺失， 得到的α型芋螺多肽的衍生物；(II)將所述α型芋螺多肽或⑴α型芋螺多肽的衍生物進行環化、脂化或PEG化修飾，得到的α型芋螺多肽的衍生物；(III)將所述α型芋螺多肽或⑴α型芋螺多肽的衍生物與載體聯接，得到的α 型芋螺多肽的衍生物；(IV)將一個或幾個所述α型芋螺多肽或(I) α型芋螺多肽的衍生物連接為多聚體，得到的α型芋螺多肽的衍生物。所述的α型芋螺多肽中，可對側鏈氨基酸進行修飾，這些殘基的修飾可以增強肽的生物活性或者靶向的選擇性。所述取代還可以是“保守性取代”或“非保守性取代”。取代可以是一個氨基酸的取代，也可以是多個氨基酸的取代，可以是連續的取代，也可以是分散的取代。“保守性取代”將所述的α型芋螺多肽中的一個或多個氨基酸殘基用構象為D-型的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸或人工修飾的氨基酸替換，以增加生物利用度及提高抑制活性；D-型的氨基酸指與組成蛋白質的L-型的氨基酸相對的氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括組成蛋白質的不常見氨基酸和不組成蛋白質的氨基酸，如5-羥基賴氨酸、甲基組氨酸、Y -氨基丁酸、高絲氨酸等；人工修飾的氨基酸指經過甲基化，磷酸化等修飾的組成蛋白質的常見 L-型氨基酸。“非保守性取代”多肽中的一個氨基酸或多個氨基酸殘基被不同性質的氨基酸所取代，或者被非常規氨基酸所取代。所述添加，可以是一個氨基酸或者多個天然的或者非常規的氨基酸。所述缺失，也包括一個或者多個氨基酸的缺失。所述載體包括但是不局限于蛋白質、聚乙二醇、脂類物質等。幾個(1-4個)相同的α型芋螺多肽可通過氨基酸，如賴氨酸、半胱氨酸，或者其他的分子連接在一起形成多聚體。所述藥物中還可含有阿片受體拮抗劑、阿片受體部分激動劑、去甲腎上腺素受體拮抗劑、α 2去甲腎上腺素受體激動劑、膽堿能神經拮抗劑、鈣通道阻斷劑或NMDA受體拮抗劑中的任意一種或幾種，以增強其鎮痛的效果。所述藥物中可添加藥劑學可接受的輔料，制成針劑、口服劑、直腸體給藥劑或皮膚吸收劑等不同劑型。本發明的α型芋螺多肽具有以下特點1、本發明的α型芋螺多肽具有很強的鎮痛活性，其中Τ-2、Τ-3、Τ_4四個肽在肌肉注射劑量在很低的情況下(lOnmol/kg)既可使痛閾率提高40%以上，T-I可使痛閾率提高 80%以上，T-5、T-6、T-7也可使痛閾提高20%以上。2、本發明的α型芋螺多肽來自中國南海芋螺，具有全新的氨基酸組成，與目前報道的α型芋螺多肽在氨基酸組成上具有顯著差異。3、本發明的α型芋螺多肽作用于外周神經系統，給藥方式為皮下、肌肉或腹腔注射，與現有的鎮痛藥物MVIIA的鞘內給藥方式相比，應用更便利。


圖1為Τ-2、Τ-3、Τ-4、Τ-5、Τ_6和Vcl. 1折疊24h后的色譜分析圖；A :T_2折疊圖； B :Τ-3折疊圖；C :Τ-4折疊圖；D :Τ-5折疊圖；E :Τ_6折疊圖；F =Vcl. 1折疊圖。圖2為T-l、Τ-7第一步折疊和第二步折疊后的色譜分析圖；A =T-I第一步氧化折疊圖；B =T-I第二步氧化折疊圖；C :Τ-7第一步氧化折疊圖；D :Τ-7第二步氧化折疊圖。圖3 為 T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T_7、Vcl. 1 多肽純化后的色譜分析圖；A =T-I 純化分析圖；B :T-2純化分析圖；C :Τ-3純化分析圖；D :Τ-4純化分析圖；E :Τ_5純化分析圖；F :Τ-6純化分析圖；G :Τ-7純化分析圖；H =Vcl. 1純化分析圖。圖4 為 T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T_7、Vcl. 1 多肽的鎮痛活性。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例1、α型芋螺多肽的發現1、芋螺總RNA的提取從西沙群島、海南三亞等地采集6種芋螺活體作為樣本材料，分別采用Trizol 法提取6種芋螺的總RNA。6種芋螺大理石芋螺(Conus marmoreus)、堂皇芋螺(Conus imperial is) > fW ^ili (Conus litteratus) > H ^ili (Conus emaciatus)、少女宇 累 (Conus eberneus)、小牛芋螺(Conus vitulinus)。Trizol法提取總RNA的具體步驟①先于冰上取芋螺毒腺管，將其置于液氮中冷凍并用研磨器研成粉末，倒入事先冰浴的微量勻漿器中。②吸取1. 2ml Trizol加入勻漿器并進一步研磨使芋螺組織裂解釋放RNA。③將研磨好的漿液倒入1. 5ml的離心管中，室溫靜置5min。④加入20%氯仿240 μ 1，劇烈震蕩15s后，放于冰上lOmin。⑤4°C、12000rpm離心15min，小心轉移上清到一新的離心管中，加入高鹽沉淀液 250 μ 1、異丙醇250 μ 1，反復顛倒30次左右，再放于冰上IOmin。⑥ 4°C、12000rpm，離心 lOmin，棄去上清。⑦加入1. 2ml 75% 乙醇混勻，4°C、9045rpm 離心 5min。⑧棄去上清，空氣中干燥lOmin，加入50-80 μ 1 DEPC溶解沉淀，溶液即為RNA溶液，于-80°C保存備用。2、cDNA 的合成采用大連iTaKafci公司的 3，Full_RACE 試劑盒(3，-Full RACE Core Set Ver 2. 0)進行cDNA的合成，具體方法如下按下列比例混合樣品
RNase Free ddH204. 5 μ 1
3，RACE Adaptor (5 μ Μ)1 μ 1
RNA (1. 5 μ g total RNA)1 μ 1 混勻后，70° C變性lOmin，冰上急冷^iin。
上述反應溶液6. 5 μ 1
dNTP MixturedOmM each)1 μ 1
RNase Inhibitor0.25 μ 1
Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)0. 25 μ 15 X M-MLV Buffer2 μ 1混勻后，42°C反應lh，70°C反應15min，反應結束后的反轉錄產物于_20°C保存。3、芋螺毒素cDNA的3，-RACE擴增以步驟2合成的cDNA為模板，根據芋螺多肽A超家族α芋螺多肽信號肽區域設計α -CTX外側引物Fl和內側引物F2，分別和3，-RACE外側引物Rl，3 ’ -RACE內側引物R2 進行巢式PCR。Fl :5’ -ATGGGCATGCGGATGATGTTC-3，；F2 :5， -CTGTTGGTTGTCTTGGCAACCAC-3，；Rl :5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3，；R2 5 ’ -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’。具體步驟第一輪PCR反應體系包括反轉錄的cDNA模板3 μ 1，1 X cDNA Dilution Buffer 117 μ 1，上游引物 Fl 2 μ 1，3，-RACE 夕卜側弓| 物 Rl 2 μ 1，10XLA PCR Buffer II (Mg2+plus) 5 μ LTaKaRa LA Taq (5U/ μ 1)0. 25 μ 1，用滅菌的去離子水補齊總體積 50 μ 1。 進行PCR的循環條件為94°C預變性4分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒 (桶形芋螺及密碼芋螺為lmin)，30個循環，最后在72°C延伸lOmin，4°C保溫。第二輪PCR 反應體系包括第一輪 PCR 產物 1 μ 1，dNTP Mixture (各 2. 5mM) 8 μ 1， 10XLA PCR Buffer II (Mg2+plus) 5 μ 1，3，-RACE 內側引物 R2 2口1，下游引物卩2 2μ 1, TaKaRa LA Taq (5U/μ 1) 0. 5 μ 1，用滅菌的去離子水補齊總體積50 μ 1。進行PCR的循環條件為94°C預變性4分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒(桶形芋螺及密碼芋螺為lmin)，30個循環，最后在72°C延伸10min，4°C保溫。PCR產物取8 μ L點樣，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，在圖像分析儀下紫外透射觀察分析照相。4、PCR產物的克隆與測序用膠回收試劑盒回收上述特異PCR產物(300bp-800bp)與載體連接，6種PCR產物與pGM-T載體(TIANGEN生物公司)連接；轉化大腸桿菌DH5 α，利用氨芐青霉素抗性挑選單克隆，37°C、220rpm進行搖菌，再通過PCR法挑選陽性克隆進行測序，PCR反應體系為反應菌液 1 μ 1，3，_RACE 內側引物 R2 1口1，下游引物卩2 1 μ l,2XTaq PCRMaster Mix (Τ IANGEN 生物公司)12. 5 μ 1，ddH20 9. 5 μ 1，總反應體系為25 μ 1，反應條件同第二輪PCR的循環條件，陽性克隆進行測序，經過序列的分析和比對，獲得了本發明所述通式I的新型α芋螺多肽序列。通式I的新型α芋螺多肽序列是根據前肽及芋螺毒素特點推測而來，前肽是根據前體基因推測而來。6種α芋螺多肽前肽序列見表1，6種α芋螺多肽前肽編碼的多核苷酸序列見表2。表1前肽序列
權利要求
1.如下(1)或(2)或(3)所示多肽(1)氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；(2)氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；(3)氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽的制備方法如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列10所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調節pH值為8. 2，磁力攪拌對-4他，得到⑴ 所示多肽；化學合成氨基酸序列如序列表的序列11所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調節pH值為8. 2，磁力攪拌對-4他，得到⑵ 所示多肽；化學合成氨基酸序列如序列表的序列12所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調節pH值為8. 2，磁力攪拌對-4他，得到(3) 所示多肽。
3.權利要求1或2所述多肽的編碼基因。
4.如權利要求3所述的基因，其特征在于所述多肽的編碼基因為如下(1)序列表的序列4自5，端第139至189位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列5自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(3)序列表的序列6自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子。
5.一種用于鎮痛的藥物，其活性成分為權利要求1或2所述的多肽。
6.權利要求1或2所述的多肽在制備用于鎮痛的藥物中的應用。
7.一種鎮痛劑，為權利要求1或2所述的多肽。
8.權利要求1或2所述的多肽在制備鎮痛劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種α型芋螺多肽及其應用。本發明提供了七種多肽多肽I氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽II氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽III氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽IV氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽V氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VI氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VII氨基酸序列如序列表的序列13所示。經過活性測定發現通式I的7個多肽具有鎮痛作用，其中α芋螺多肽T-1、T-2、T-3、T-4具有顯著的鎮痛活性，T5-T7也有明顯鎮痛活性，在鎮痛方面具有應用價值。
文檔編號A61P29/00GK102304171SQ20111025834
公開日2012年1月4日 申請日期2010年3月10日 優先權日2010年3月10日
發明者于正, 劉珠果, 吳巧玲, 孫婷, 戴秋云, 胡潔 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所