專利名稱：火絨草屬植物提取物及其活性成分在治療肝炎中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物提取物及其活性成分在肝炎治療上的應用，尤其是含火絨草 素類化合物的火絨草屬植物提取物、火絨草素及其衍生物、含火絨草素的藥物組合物在制 備治療乙型肝炎藥物上的用途。
背景技術：
肝炎是肝臟發生炎性病變的總稱，根據病因可分為病毒性、酒精性、藥源性和自身 免疫性肝炎等，以病毒性肝炎為多見，其中以乙型肝炎為主，丙型肝炎次之。乙型肝炎是由 乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種危害極大的世界性流行的傳染病，據統計目前全世界約有 3. 5億HBV攜帶者，而中國是HBV高感染地區，HBV攜帶者占總人口比例高達10% 15%， 其中慢性乙肝患者約3000萬例，每年約有35萬人死于慢性乙肝相關疾病。1990年起我國 開展的新生兒疫苗接種雖然顯著降低了兒童慢性乙肝感染率，但并未遏止乙肝發病率的上 升趨勢，大量已感染HBV的攜帶者和慢性患者依然存在，乙肝及其相關疾病仍是我國面臨 的嚴重公共衛生問題。HBV主要通過血液和性接觸傳播，母嬰垂直傳播也很常見。成人感染 HBV多表現為無癥狀感染或急性肝炎，約有15% 20%患者轉為慢性攜帶者和慢性患者， 部分慢性乙肝患者進一步轉化為肝硬化和原發性肝細胞性肝癌。盡管國內外科學家研制了 一些新的抗乙肝藥物(如干擾素和核苷類似物)可一定程度控制病情發展，但其療效距離 清除病毒感染、治愈絕大多數乙肝患者及病毒攜帶者的目標尚有很長的距離，而且長期應 用易出現耐藥和不同程度的反跳。因此，繼續研制高效低毒的抗乙肝藥物仍是當務之急。火絨草屬(Leontopodium genus)是菊科(Asteraceae)的一個屬，全球約有56 種植物，主要分布于亞洲、歐洲和南美洲，寒帶、溫帶、亞熱帶及熱帶均有分布。我國約有41 種，主要分布于東北、西北、華北及西南地區，特別是青藏高原尤為豐富。其中有25種在民 間作為藥用植物，如火絨草(Leontopodiumleontopodioides)、高山火絨草(Leontopodium alpinum)、黃白火絨草(Leontopodium ochroleucum)、香蕓火絨草(Leontpodium haplophytloides)、薄雪火客戎草(Leontopodium japonicum)、美頭火客戎草(Leonfopodium calocephalum)、卓戈葉火絨草(Leontopodium dedekensii)、長葉火絨草(Leontopodium longifolium)、絹鸞火絨草(Leontopodium smithianum)、華火絨草(Leontopodium sinense)、剪花火客戎草(Leontpodium conglobatum)禾口矮火客戎草(Leontopodium nanum) > (Leontopodium coreanum)、 Leontopodium campestre, Leontopodium francheti, Leontopodium palbinianum, Leontopodium souliei, Leontopodium subulatum 等。火M 草屬植物民間廣泛用于治療腎炎、肝炎、流行性感冒、瘟病時疫、支氣管炎等炎癥性和感染 性疾病。本發明人針對肝炎對火絨草屬植物的化學成分和藥理活性進行了系統研究，結果 表明火絨草素(Leontopodic acid)類化合物及其衍生物是火絨草屬植物的活性成分，該 類化合物和含該類化合物的植物提取物對乙型肝炎模型(HBV基因轉染H印G2. 2. 15細胞模 型、鴨乙肝模型和HBV轉基因小鼠模型)、肝損傷模型(D-GalN、CC14、醋氨酚誘發的肝損傷
4和BCG-LPS介導的免疫性肝損傷)和急慢性炎癥模型(二甲苯致小鼠耳腫脹模型、角叉菜 膠致大鼠足腫脹模型、大鼠棉球肉芽腫模型)具有顯著抑制作用。因此，火絨草素類化合物 和含火絨草素類化合物的火絨草屬植物提取物，預期可以成為治療肝炎尤其是乙型肝炎的 藥物。文獻檢索表明，到目前為止，尚無火絨草素類化合物和含火絨草素類化合物的植物提 取物治療肝炎和制備抗肝炎藥物的報道。本發現具有新穎性和創造性，故而完成本發明。

發明內容
本發明的目的是克服上述背景技術的不足，提供一種新的治療肝炎尤其是乙型肝 炎的藥物，其具有顯著的療效、毒副作用很低，且長期用藥無耐藥和反跳發生。本發明的第一個目的涉及一種含火絨草素(Leontopodic acid)類化合物的植物 提取物在治療肝炎上的應用，該提取物具有顯著的抗乙肝病毒、抗炎保肝和免疫調節作用。 火絨草素(分子式C37H33019，分子量781. 16)本發明的另一目的涉及火絨草素及其衍生物在制備用于治療乙肝病毒感染相關 疾病的藥物中的用途。本發明的再一目的涉及含火絨草素的藥物組合物，該藥物組合物對乙型肝炎具有 顯著治療作用。根據本發明，該藥物組合物中除作為活性成分的火絨草素外，可加有各種藥 物賦形劑和載體。根據本發明，本發明的火絨草素類化合物，主要分離自菊科火絨草屬植物，如從 火絨草(Leontopodium leontopodioides)、高山火絨草(Leontopodiumalpinum)、黃白 火絨草(Leontopodium ochroleucum)、香蕓火絨草(Leontpodiumhaplophytloides)、 薄雪火絨草(Leontopodium japonicum)、美頭火絨草(Leonfopodium calocephalum)、 卓戈葉火絨草(Leontopodium dedekensii)、長葉火絨草(Leontopodium longifolium)、 絹鸞火絨草(Leontopodium smithianum)、華火絨草(Leontopodium sinense)、剪花火 絨草(Leontpodium conglobatum)禾口矮火絨草(Leontopodium nahum)、(Leontopodium coreanum)、 Leontopodiumcampestre， Leontopodium francheti， Leontopodium palbinianum，Leontopodiumsouliei, Leontopodium subulatum 等植物中分離制備。也可通過全合成或半合成方法制備。根據本發明，火絨草素可從上述植物中通過以下提取路線制備1)取干燥藥材，經乙醇常壓回流提取三次，經提取液合并后，減壓濃縮回收乙醇， 制得棕黑色浸膏；2)將制得的棕黑色浸膏用蒸餾水溶解后，分別用石油醚和乙酸乙酯等反復萃取， 除去中小極性部位后，得到提取物的大極性部位；3)將剩下的大極性部位分別通過RP-18和S印hadex LH-20柱層析，并用甲醇洗脫 分離出一種淺黃色的粉末，即火絨草素(Leontopodic acid)。根據本發明，火絨草屬植物提取物可由火絨草屬植物鮮品或干品經醇水提取、柱 層析、醇溶劑洗脫精制而成。該提取物中按比色法測定酚性化合物含量在20%以上。根據本發明，通過采用H印G2. 2. 15細胞模型和D-半乳糖胺(D_GalN)誘發肝損傷 模型對火絨草不同提取物進行了大量篩選，確定其抗乙肝藥效部位，分離鑒定其藥效成分， 并采用乙肝模型0fepG2. 2. 15細胞模型、鴨乙肝模型和HBV轉基因小鼠模型)、肝損傷模型 (D-GalN、CC14、醋氨酚誘發的肝損傷和BCG-LPS介導的免疫性肝損傷)和急慢性炎癥模型 (二甲苯致小鼠耳腫脹模型、角叉菜膠致大鼠足腫脹模型、大鼠棉球肉芽腫模型)對火絨草 提取物的抗乙肝作用進行了深入研究。初步藥效研究表明火絨草屬植物提取物具有顯著 的抗乙肝病毒、抗炎保肝和免疫調節作用，其藥效優于陽性藥物“拉米夫定”和“水飛薊臏”， 且長期用藥后未出現耐藥和“反跳”現象，未見明顯毒性反應。根據本發明，含有火絨草素類化合物的火絨草屬植物提取物、火絨草素及其衍生 物、含火絨草素的藥物組合物，均具有顯著的抗乙肝病毒、抗炎保肝和免疫調節作用，從而 可能開發成抗乙肝藥物。本發明的藥物可用醫藥領域的已知技術制成，可以制成腸道或非 腸道給藥的各種劑型，如膠囊、片劑、顆粒劑、滴丸、注射劑、口服液、緩釋或控釋劑等劑型。 這些藥物可用于預防和治療肝炎等用途。
具體實施例方式為了更好地理解本發明的實質，下面分別用實施例的形式說明含有火絨草素類化 合物的火絨草屬植物提取物在醫藥領域中的新用途。藥理實施例給出了火絨草屬植物提取 物的部分活性數據。同樣必須說明，本發明的實施例是用于說明本發明而不是對本發明的 限制。根據本發明的實質對本發明進行的簡單改進都屬于本發明要求保護的范圍。實施例1 火絨草屬植物提取物對H印G2. 2. 15細胞分泌乙肝病毒表面抗原 (HBsAg)、乙肝病毒E抗原(HBeAg)和乙肝病毒DNA(HBV-DNA)的抑制作用。測定樣品對H印G2. 2. 15細胞生長的抑制作用將細胞用胰蛋白酶-EDTA消化并稀 釋成1 X 105/mL,加到96孔細胞培養板中，每孔100uL,置C02培養箱中培養。接種24h后， 傾去培養基，加入用培養基稀釋的樣品，每孔200ul，每個濃度加3孔，培養72h后在細胞培 養孔中加入5mg/ml的MTT，每孔10ul，置37°C孵育3h，加入DMS0 150ul，使甲臢完全溶解， 用酶標儀在570nm波長下比色。計算樣品對H印G2. 2. 15細胞生長的半數中毒濃度。測定樣品對HBV的抑制作用每4天換含無毒濃度樣品的培養基，將同一樣品同一 濃度的換出的培養基等體積混勻，作為待測樣品。用ELISA試劑盒測定培養基中HBsAg和 HBeAg濃度；用HBV-DNA定量PCR試劑盒測定培養基中HBV-DNA濃度。
抗HBV作用評價以轉染有HBV DNA細胞株0fepG2. 2. 15)為模型，通過被測樣品 對細胞培養上清中的HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的影響情況，來評價樣品的抗HBV的作用。表1火絨草屬植物提取物對H印G2. 2. 15細胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的抑
制作用 結果表明，含火絨草素類化合物的火絨草屬植物提取物對H印G2. 2. 15細胞分泌 HBsAg、HBeAg具有較強抑制作用，對HBV-DNA復制也具有較強的抑制作用。實施例2火絨草屬植物提取物對D-GalN致肝細胞損傷的影響人正常肝細胞株HL-7702，置37°C下C02培養箱中培養；待肝細胞貼壁后，更換 培養液，加入200mmol/l的D_GalN，作用8h ；然后棄去培養液，分別加入不同濃度的試驗 藥液各200 yl，每一濃度設6個復孔，同時設溶劑和陽性對照；繼續培養48h，每孔加入 10iilMTT(5mg/ml)，作用4h，吸棄上清，加入150iil DMS0，振蕩混勻；在570nm波長下，用酶 標儀測定A值。保護作用評價計算保護率(％ )和增生指數。 注2 增生指數=樣品組(A)/損傷組(A)表2火絨草屬植物提取物對D-GalN致人正常肝細胞損傷的影響 結果表明，含火絨草素類化合物的火絨草屬植物提取物對D-GalN誘導的肝細胞 損傷具有明顯的保護作用，其作用優于陽性對照藥物水飛薊臏。實施例3火絨草屬植物提取物對D-GalN致小鼠急性肝損傷模型的保護作用取材取20_25g、雄性，ICR小鼠，按體重隨機分組，每組10只。設正常對照組、損 傷對照組、陽性對照組和試藥高、中、低劑量組。藥物組動物預防給藥，每天1次，連續7天。 正常對照組及損傷對照組給予等體積的溶劑，陽性對照組給予水飛薊素50mg/kg。末次給藥 后lh，除正常組外，各組動物腹腔注射650mg/kg氨基半乳糖(D-GalN)致毒。末次給藥24h 后，分離血清，測谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)。同時取肝組織用于制作病理切片。療效評價比較治療組與損傷對照組間AST和ALT差異的顯著性，以及病理學變化 的改善。表3火絨草屬植物提取物對D-GalN誘發的小鼠急性肝損傷的影響(5 士 S)
組別
劑量 (mg/kg)
AST (IU/1)
ALT (IU/1)
溶劑對照-46.77士4. 25***30.54土3. 26*"模型對照-188.26 ± 9.3787.256. 02水飛薊臏5095.44士6. 12***55.,24士5. 27*2585.25土5. 78*"45.39+5. 88"火絨草屬植物提 取物5064.37±5. 22*"35.64士3. 89*"10056.58士5.32.18土3. 78_與模型對照比較，*P < 0. 05，**P < 0. 01，和< 0. 001，即與模型對照組相比具
有顯著的差異。結果表明，含火絨草素類化合物的火絨草屬植物提取物對D-GalN急性肝損傷小鼠血清轉氨酶具有顯著抑制作用，且能明顯改善D-GalN急性肝損傷組織學病變。其作用優 于陽性對照藥物水飛薊臏。實施例4火絨草屬植物提取物對CC14致小鼠急性肝損傷模型的保護作用取體重20_25g雄性ICR小鼠，按體重隨機分組，每組10只。設正常對照組、損傷對 照組、陽性對照組和試藥高、中、低劑量組。藥物組動物預防給藥，每天1次，連續7天。正 常對照組及損傷對照組給予等體積的溶劑，陽性對照組給予水飛薊臏50mg/kg。末次給藥后 lh，除正常組外，各組動物腹腔注射的CC14橄欖油溶液(10ml/kg)致毒。末次給藥24h 后，分離血清，測谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)。同時取肝組織用于制作病理切片。療效評價比較治療組與損傷對照組間AST和ALT差異的顯著性，以及病理學變化 的改善。表4火絨草屬植物提取物對CC14誘發的小鼠急性肝損傷的影響(5 士 S) 與模型對照比較，*P < 0. 05，**P < 0. 01，和< 0. 001，即與模型對照組相比具
有顯著的差異。結果表明，含火絨草素類化合物的火絨草屬植物提取物對CC14急性肝損傷小鼠血 清轉氨酶具有顯著抑制作用，且能顯著改善CC14急性肝損傷組織學病變。其保護作用優于 陽性對照藥物水飛薊臏。
權利要求
一種含火絨草素(Leontopodic acid)類化合物的植物提取物、火絨草素及其衍生物、含火絨草素的藥物組合物在制備治療肝炎的藥物，尤其是治療乙肝病毒感染相關疾病的藥物中的用途火絨草素(分子式C37H33O19，分子量781.16)F2009100975212C0000011.tif
2.權利要求1所述的火絨草素類化合物，其特征在于該化合物主要從菊科 (Asteraceae)火絨草屬(Leontopodium genus)植物中分離制備。或通過全合成或半合成 制備。
3.權利要求1所述的含火絨草素類化合物的植物提取物，其特征在于該提取物主要 從火絨草(Leontopodium leontopodioides)、高山火絨草(Leontopodiumalpinum)、黃 白火絨草(Leontopodium ochroleucum)、香蕓火絨草(Leontpodiumhaplophyloides)、 薄雪火 M 草(Leontopodium japonicum)、美頭火 M 草(Leonfopodium calocephalum)、 卓戈葉火絨草(Leontopodium dedekensii)、長葉火絨草(Leontopodium longifolium)、 絹鸞火絨草(Leontopodium smithianum)、華火絨草(Leontopodium sinense)、剪花火 客戎草(Leontpodium conglobatum)禾口矮火客戎草(Leontopodium nanum) > (Leontopodium coreanum)、Leontopodiumcampestre, Leontopodium francheti, Leontopodium palbinianum, Leontopodiumsouliei, Leontopodium subulatum 等火M草屬植物藥材中提 取。
4.權利要求1所述的火絨草素及其衍生物，其特征在于火絨草素及其衍生物的單一成 分與不同組合。
5.權利要求1所述的含火絨草素的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物中除作為活 性成分的火絨草素外，可加有各種藥物賦形劑和載體。
6.根據權利要求2所述的火絨草素的提取方法，其特征在于該提取物按照如下步驟制1)取干燥藥材，經乙醇常壓回流提取三次，經提取液合并后，減壓濃縮回收乙醇，制得 棕黑色浸膏；2)將制得的棕黑色浸膏用蒸餾水溶解后，分別用石油醚和乙酸乙酯等反復萃取，除去中小極性部位后，得到提取物的大極性部位；3)將剩下的大極性部位分別通過RP-18和S印hadex LH-20柱層析，并用甲醇洗脫分離 出一種淺黃色的粉末，即火絨草素(Leontopodic acid)。
7.權利要求3所述的含火絨草素類化合物的植物提取物的提取方法，其特征在于該提 取物可由火絨草屬植物鮮品或干品經醇水提取、柱層析、醇溶劑洗脫精制而成。該提取物中 按比色法測定酚性化合物含量在20%以上。
8.權利要求1 7所述的含火絨草素類化合物的火絨草屬植物提取物、火絨草素及其 衍生物、含火絨草素的藥物組合物，具有顯著的抗乙肝病毒、抗炎保肝和免疫調節作用。可 以制成腸道或非腸道給藥的各種劑型，如膠囊、片劑、顆粒劑、滴丸、注射劑、口服液、緩釋或 控釋劑等劑型，用于預防和治療肝炎等用途。
全文摘要
本發明涉及含火絨草素(Leontopodic acid)類化合物的火絨草屬植物提取物、火絨草素及其衍生物、含火絨草素的藥物組合物在治療肝炎上的應用，尤其是在制備治療乙型肝炎藥物上的用途。本發明的火絨草素及含火絨草素類化合物的火絨草屬植物提取物，具有顯著的抗乙肝病毒、抗炎保肝和免疫調節作用，可以用于肝炎的治療，尤其是用于乙肝病毒感染相關疾病的治療。
文檔編號A61P1/16GK101856347SQ20091009752
公開日2010年10月13日 申請日期2009年4月8日 優先權日2009年4月8日
發明者伍義行, 郝冰潔 申請人:伍義行