專利名稱：倍半萜香豆素醚的提取純化方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種化工技術領域的方法，更具體地，涉及一種倍半萜香豆素醚的提取純化方法及其應用。

背景技術：
青蒿為我國著名的傳統中草藥，具有清熱，解暑，除蒸；治溫病，暑熱，骨蒸勞熱，瘧疾，痢疾，黃疸，疥瘡，瘙癢。青蒿根能治療熱骨蒸、關節酸痛、大便下血；果實(青蒿子)能清熱淚盈眶明目，殺蟲。其產生的抗瘧倍半萜青蒿素被世界衛生組織認定為21世紀替代奎寧的最有效的抗菌素瘧疾藥。二次開發青蒿資源，產生新的具有生物活性的物質，是進一步利用中草藥，實現中藥現代化的有利手段。利用發根快速生產的特征，大規模生產植物次級代謝物一直是植物細胞工程的常用技術；利用發根積累次級代謝產物的特點還可以用來發現植物本身低含量的次級代謝產物，從而完善植物的代謝譜，并且可以發現新的生物活性物質，并以此為模型研究植物的次級代謝調控規律，具有重要的生產潛力和學術價值。
倍半萜香豆素醚(Drimartol A)為白色針狀晶體，在薄層硅膠板GF254上紫外下顯蘭色熒光。
經過對現有技術的檢索發現，在期刊Journal of Natural Products第45卷第四期，New sesquiterpene courmain from Achillea and Artemisia species一文中，報道了從西北蒿，伊朗蒿，老人蒿，蓍草和毛連蒿中分離到倍半萜香豆素醚的例子，但是在該文獻中的方法采用石油醚冷浸提取的方法，此方法分離時間長，分離效率低，消耗溶劑多。


發明內容
本發明的主要目的在于克服現有技術的不足，提供一種倍半萜香豆素醚的提取純化方法及其應用。該制備方法簡單、制備原料易得；同時由于該化合物具有明顯的抗腫瘤活性，因此可以應用于化學預防和治療腫瘤和開發相關抗腫瘤藥物。
本發明是通過以下技術方案實現的本發明所涉及的倍半萜香豆素醚的提取純化方法包括以下步驟 第一步、提取將青蒿發根粉碎，用5到10倍體積量的甲醇作為溶劑進行超聲提取，超聲2到5次，將提取液旋轉蒸發，濃縮得到浸膏，通過乙酸乙酯和水雙相分散，萃取分層，取上層乙酸乙酯有機相，濃縮至原體積的1/20時，用于下一步的柱層析； 所述超聲提取，每次持續時間為30分鐘。
第二步、分離在上述的萃取濃縮液中加入吸附劑，成固體粉末狀，然后上硅膠柱進行柱層析，用石油醚和乙酸乙酯混合洗脫液進行洗脫，然后進行薄層層析檢測，收集含所述倍半萜香豆素醚的組分，濃縮得到倍半萜香豆素醚的濃縮液； 所述吸附劑為100到200目的硅膠。
所述硅膠柱為100到200目，且規格為4040×800mm的硅膠柱。
所述石油醚和乙酸乙酯的混合洗脫液是指石油醚與乙酸乙酯的體積比為1比3的混合溶液。
第三步、純化將第二步中得到的濃縮液進一步濃縮成浸膏后，用等體積甲醇分散，以尼龍膜過濾，經制備液相ODS RP-C18反相柱進行純化，以甲醇和水的混合溶液進行洗脫，濃縮對應組分。
所述尼龍膜是指孔徑為0.45um的尼龍膜。
所述甲醇和水的混合溶液是指甲醇體積比例為78％，水的體積比例為22％的混合溶液。
采用本發明方法得到的倍半萜香豆素醚，可以應用于腫瘤的預防和治療。所述腫瘤為肺癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、高轉移肺癌和胰腺癌中的一種或幾種。
本發明首次從青蒿發根中分離得到倍半萜香豆素醚，制備方法簡便、原料易得，采用甲醇超聲萃取，進一步可用柱層析純化結晶，還可用制備液相直接分離純化出高純度的晶體，為大規模工業自動化生產提供了可能。大大節省了分離時間，提高了分離效率。由此，本發明也用于可開發上述含有倍半萜香豆素醚的植物資源。
本發明還首次發現倍半萜香豆素醚具有明顯的抗腫瘤活性，通過流式細胞儀分析了倍半萜香豆素醚對腫瘤細胞周期的影響，在此基礎上提供了其在腫瘤預防治療中的實際應用，對于開發相關抗腫瘤藥物以及青蒿資源的二次開發均具有重要意義。



圖1倍半萜香豆素醚對六個腫瘤細胞株的生長抑制示意圖。
圖2倍半萜香豆素醚對HO8910細胞形態學的影響圖； 其中A為DMSO對照組的正常細胞形態；B為倍半萜香豆素醚組誘導HO8910細胞凋亡形態圖。
圖3倍半萜香豆素醚的制備液相色譜圖。

具體實施例方式 以下結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 倍半萜香豆素醚的制備 1.將菊科艾屬植物青蒿誘導得到的發根進行培養，培養條件為基礎MS培養基+蔗糖30g/L，光周期光照16h/黑暗8h，25℃，搖床轉速110r/min；獲得生長到穩定期的青蒿發根； 2.將生長到穩定期的青蒿發根200g取出曬干后，用粉碎機粉碎，粉碎過的樣品均需過60目篩。未能過篩部分再次粉碎或經研缽內研磨之后再過篩，直至全部樣品過篩為止； 3.以2L甲醇浸泡樣品粉末，超聲2次，每次30min，中間搖勻，間隔10min，注意控制水溫不超過50℃。提取完畢后，過濾，取濾液，旋轉蒸發后濃縮得棕色浸膏(15g左右)，再用1L體積比為1∶1的乙酸乙酯和水雙相萃取，取上層乙酸乙酯有機相，將有機相旋轉蒸發減壓濃縮至萃取體積的約1/20(約25mL)時，加入吸附劑(硅膠100~200目)，成固體粉末狀。然后上硅膠柱進行柱層析(硅膠100~200目，硅膠柱規格40×800mm)，用體積比為1比3的石油醚和乙酸乙酯的混合洗脫液進行洗脫；然后用TLC薄層檢驗倍半萜香豆素醚的存在，在GF254的硅膠板上，以體積比為1∶3的石油醚∶乙酸乙酯為展開劑，紫外下顯藍色熒光，RF值0.5左右。
4.收集含所述倍半萜香豆素醚的組分，旋轉蒸發，濃縮得到所述倍半萜香豆素醚。純度約為85％，進一步，用少量甲醇完全溶解所得產物，于-20℃重結晶，可得到純度大于98％的晶體220mg。該化合物倍半萜香豆素醚為白色針狀晶體。
5.高分辨質譜得到該化合物的精密質量數為442.2357，推算其分子式為C26H34O6。
由1H和13C-NMR數據以及文獻(Bohlmann，F.etal.，Chem.Ber.，1974.(107)644；1975.(108)1902)數據對比得知此物質為倍半萜香豆素醚。
6.將所分離得到的倍半萜香豆素醚用DMSO溶解配成5mg/mL的濃縮液，分別進行細胞毒性實驗和細胞周期實驗。
實施例2 倍半萜香豆素醚drimartolA的柱層析分離 1.將生長到穩定期(14~18天)的青蒿發根200g取出曬干后，用粉碎機粉碎，粉碎過的樣品均需過60目篩。未能過篩部分再次粉碎或經研缽內研磨之后再過篩，直至全部樣品過篩為止。
2.以2L甲醇浸泡樣品粉末，超聲五次，每次30min，注意控制水溫不超過50℃。提取完畢后，過濾，取濾液，旋轉蒸發后濃縮得棕色浸膏(17.3g左右)，直接用石油醚∶乙酸乙酯(體積比1∶3)50mL分散所得浸膏，可輔助超聲5~10min，然后過濾，將濾液應用于硅膠柱進行柱層析(硅膠100~200目，硅膠柱規格40×800mm)，用石油醚∶乙酸乙酯(體積比1∶3)洗脫。用TLC薄層檢驗DrimartolA的存在，在GF254的硅膠板上，以石油醚∶乙酸乙酯(體積比1∶3)為展開劑，紫外下顯藍色熒光，RF值0.5左右。
3.收集含所述倍半萜香豆素醚DrimartolA的組分，旋轉蒸發，濃縮得到所述倍半萜香豆素醚。純度約為83％，進一步，用少量甲醇完全溶解所得產物，于-20℃重結晶，可得到純度大于98％的晶體233mg。
實施例3 倍半萜香豆素醚drimartolA的制備液相分離法 1.將生長到穩定期(14~18天)的青蒿發根200g取出曬干后，用粉碎機粉碎，粉碎過的樣品均需過60目篩。未能過篩部分再次粉碎或經研缽內研磨之后再過篩，直至全部樣品過篩為止。
2.以2L甲醇浸泡樣品粉末，過夜，超聲三次，每次30min，中間搖勻，間隔5~10min，注意控制水溫不超過50℃。提取完畢后，過濾，取濾液，旋轉蒸發后濃縮得棕色浸膏(15.8g左右)，再用1L乙酸乙酯和水(體積比1∶1)雙相萃取，取上層乙酸乙酯有機相，將有機相旋轉蒸發減壓濃縮成浸膏(約9.6g)，再用萃取體積的1/20的甲醇重新分散浸膏(可以輔助用超聲超5~10分鐘)，用0.45m的尼龍濾膜過濾，取濾液用于制備液相的分離純化。
色譜條件為 色譜柱大連依利特Hypersil ODS2，5m，10×250mm； 流速3.6mL/min； 檢測波長220nm； 流動相甲醇∶水＝78∶22(v/v) 等梯度洗脫，目的產物Drimartol A出峰時間約為21.2min。
收集相應組分旋轉蒸發濃縮后，可得純度大于98％的倍半萜香豆素醚純品257mg。
實施例4 細胞毒性實驗 實驗材料細胞株A-549(人肺癌細胞)，HO8910(人卵巢癌細胞)，QGY(人肝癌細胞株)，Hela(人子宮頸癌細胞)，95D(人高轉移肺癌細胞)，SW1990(人胰腺癌細胞株)均購自中國科學研究院上海細胞所。SW1990，HO8910，QGY，Hela，95D細胞均用RPMI1640培養基加10％胎牛血清常規培養傳代，A549細胞用F12K培養基加10％胎牛血清常規培養傳代，各細胞置5％CO2培養箱，37℃培養。
實驗方法國際通用的MTT法根據細胞生長速率，將處于對數生長期的腫瘤細胞以100L/孔接種于96孔培養板，接種密度為10000~20000/孔，貼壁生長5~18h再加藥1？L/孔。每個濃度設5個復孔。并設置相應濃度的溶媒對照以及無細胞調零孔。每個細胞株重復5次。腫瘤細胞在37℃，5％CO2條件下培養24小時。藥物作用結束前4小時，加MTT，終濃度為50？g/mL。5％CO2孵箱37℃繼續孵育4小時后，在酶標儀上測定570nm和630nm的吸光度值。計算抑制率 細胞抑制率＝[1-(測試組OD平均值空白組OD平均值)/(對照組OD平均值空白組OD平均值)]×100％。
實驗結果參見表1和圖1，化合物倍半萜香豆素醚能夠抑制A-549，HO8910，QGY，Hela，95D，SW1990的生長，IC50見表1。由表1可知化合物倍半萜香豆素醚對各個腫瘤細胞的IC50均小于20g/mL，可以認為倍半萜香豆素醚具有明顯的抗腫瘤活性和寬廣的抗腫瘤譜。
表1倍半萜香豆素醚對六個腫瘤細胞株的IC50(g/mL)值 實施例5 細胞周期實驗 1.實驗方法常規培養法培養Hela細胞，給藥，以等體積溶媒作為對照，24小時后收集細胞，用PBS洗兩次后以70％酒精固定過夜。1000rpm/10min離心去乙醇，用含1％胎牛血清的PBS洗兩次，再以含1％胎牛血清的PBS重懸，調整細胞濃度約106個/mL，加入無DNA酶的RNA酶，終濃度為100U/mL，37℃保溫30min，加入PI，終濃度為50g/mL，在暗中常溫下反應30min，冰上放置20min后，進行流式細胞儀檢測，每次記錄30000個細胞。
2.實驗結果化合物倍半萜香豆素醚在20g/mL，作用24小時后，可使Hela細胞周期停止在G0/G1期。實驗結果見表2。
表2化合物倍半萜香豆素醚對Hela腫瘤細胞周期的影響 實施例6 細胞形態學觀察 1.實驗方法培養方法同實施例2，待HO8910細胞長至80％匯合，加入倍半萜香豆素醚20μg/mL作用24h后，再加入0.25％胰蛋白酶消化細胞，制備單細胞懸液，調細胞濃度為107/mL，取細胞懸液25μl，加2μLAO染液(100μg/ml)及2μL EB染液(100μg/mL)，滴于載玻片，蓋片封片后熒光顯微鏡直接觀察，于20min內計數500個細胞。溶媒對照組加等體積DMSO，陽性對照喜樹堿加藥濃度為0.5μg/mL。
AO吖啶橙/EB雙熒光染色法是一種鑒別細胞壞死和凋亡的簡便方法。AO能夠進入正常細胞膜的細胞中，與DNA結合顯綠色/黃綠色熒光。早期凋亡細胞的細胞膜正常，胞漿濃縮，核DNA濃縮致密，低倍鏡下呈熒光亢進的圓珠狀小體，高倍鏡下可見不規則的塊狀熒光。晚期凋亡細胞胞膜通透性破壞被EB染成紅色，核形態與早期凋亡細胞相似，或為濃染的紅色碎片(核碎裂)或凋亡小體。而細胞壞死時，細胞膜的完整性早期即被破壞，線粒體明顯腫脹，細胞體積明顯增大，呈不均勻的橙紅色熒光。
2.實驗結果觀察倍半萜香豆素醚對HO8910細胞形態學的影響，發現在20g/mL對HO8910細胞能引起凋亡形態學變化，陽性藥喜樹堿也能引起相似的凋亡形態學變化，實驗結果見附圖2。
綜上所述，倍半萜香豆素醚具有明顯的抗腫瘤活性，可用于化學預防和治療腫瘤和開發相關抗腫瘤藥物。
權利要求
1.一種倍半萜香豆素醚的應用，其特征在于，所述倍半萜香豆素醚應用于制備抑制腫瘤的藥物中，其在藥物中的添加量為20g/mL。
2.根據權利要求1所述的倍半萜香豆素醚的應用，其特征是，所述倍半萜香豆素醚的作用時間為24小時。
3.根據權利要求1所述的倍半萜香豆素醚的應用，其特征是，所述腫瘤是指肺癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、高轉移肺癌或胰腺癌。
全文摘要
一種化工技術領域的倍半萜香豆素醚的提取純化方法，步驟為第一步將青蒿發根粉碎，用甲醇超聲提取，將提取液旋轉蒸發濃縮得到浸膏，通過乙酸乙酯和水雙相分散萃取分層，取上層乙酸乙酯有機相作為萃取濃縮液；第二步在上述的萃取濃縮液中加入吸附劑后進行柱層析，用石油醚和乙酸乙酯混合洗脫液洗脫，然后進行薄層層析收集含倍半萜香豆素醚的組分；第三步將濃縮液進一步濃縮成浸膏后，用等體積甲醇分散，以尼龍膜過濾，經制備液相ODS RP-C18反相柱進行純化，以甲醇和水的混合溶液進行洗脫，濃縮對應組分。本發明制備方法簡單、制備原料易得，且可應用于化學預防和治療腫瘤并開發相關抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K31/37GK101816647SQ201010301379
公開日2010年9月1日 申請日期2008年7月24日 優先權日2008年7月24日
發明者鐘建江, 翟丹丹 申請人:上海交通大學