專利名稱：一種細胞片層智能脫附水凝膠及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學工程和智能高分子材料領域，具體涉及ー種細胞片層智能脫附水凝膠及其應用。
背景技術：
長期以來，供體緊缺和移植排斥反應是器官移植發展的兩大障礙。目前使用的天然材料與人工合成支架材料因強度低和降解產生炎癥等問題導致其臨床應用療效欠佳。細胞片層技術是組織工程中收獲種子細胞的ー項新技術，無需支架即可成功移植，避免了傳統支架材料移植后引發的免疫源性、誘發炎癥反應、光學干渉等問題。
細胞片層(Cell Sheet)醫療是將患者自身的細胞取出后在培養皿中培養，然后將増殖成的片層移植于患部，促使患部器官再生的技木。當細胞片層貼在因重病或重傷而導致功能無法恢復的器官上時，被稱為細胞因子的相當于生長激素的物質便會從細胞片層中分泌出來，促使毛細血管擴張，受損的細胞將復活重現。由于它是患者自身的細胞，因此不產生排斥反應。通過細胞片層技術能使糖尿病、牙周病、肺氣漏、肝功能障礙和關節功能障礙等病的患者得到治愈的可能性大大提高。中國專利CN101896600A公開了ー種圖案化的細胞片層和其生產方法。所述方法包括步驟提供布置在基底上的連續的細胞片層，所述基底包含形狀轉變性質和/或可改變的表面特性；使所述連續的細胞片層以圖案化方式暴露于釋放劑；在暴露于所述釋放劑之后洗滌所述細胞片層，以除去已被所述釋放劑影響的細胞，和使用第二細胞類型重新填充在被所述釋放劑影響的細胞已被除去之后留下的缺ロ。聚異丙基丙烯酰胺(polyN-isopropylacrylamide, PNIPAAm)具有溫度敏感性能，其體積相轉變溫度為 32。。。Yamato等(Tissue Eng.，2001，7 :473.)將PNIPAAm接枝到細胞培養板表面，于37°C條件下接種上細胞，由于PNIPAAm具有疏水性，因而細胞可進行黏附、伸展和増殖；當降低溫度至32°C以下，PNIPAAm具有親水性，體積膨脹，細胞與培養板表面分離，整體細胞群則在保持細胞間連接狀態下以片狀形態脫附，從而獲得保留細胞活性的細胞片層。通過改變溫度收獲細胞片層避免了酶消化法對細胞造成的生物學功能損傷，并可直接黏附到組織上而無需縫合，同時避免了支架材料降解成分對細胞的傷害。水凝膠是由親水性聚合物鏈構造的具有三維交聯網絡結構的高聚物和介質組成的多元體系，在藥物控釋、軟組織支架構建和細胞包載等生物醫用材料方面具有良好的應用前景。水凝膠材料作為填充缺損型支架、生物活性分子控制釋放載體以及組織/細胞的轉載系統，正朝向智能化方向發展。溫度敏感水凝膠是其體積隨環境溫度變化而改變的高分子水凝膠；pH敏感水凝膠是其體積隨環境pH值變化而改變的高分子水凝膠，這類凝膠大分子網絡中具有可解離成離子的基團(羧基、磺酸基或氨基)，可根據環境PH值變化奪取或釋放質子。利用溫度或PH響應水凝膠的軟濕特性和敏感特性，則可通過改變溫度或pH值實現細胞的片層脫附。純的合成水凝膠細胞相容性較差，在合成水凝膠中弓I入天然生物相容性單體如膠原、殼聚糖和絲膠等，則可促進細胞的増殖和脫附。由上分析可以看出，目前尚無將溫敏性或pH敏感性水凝膠、生物相容性高分子和細胞片層脫附技術相結合的報道。本發明綜合考慮了水凝膠的溫度或PH值敏感特性和軟濕特性，以及生物相容性高分子良好的細胞相容性，以去離子水作為溶劑，采用自由基聚合，制得可通過調節溫度或PH值實現細胞片層自動脫附的水凝膠，并可應用于皮膚、角膜上皮和牙周膜韌帶等組織和器官的治療與修復。

發明內容
本發明擬解決的技術問題是為有效促進細胞黏附，避免傳統的酶解法對細胞活性和功能等造成的損傷，同時降低與傳統組織工程相關的并發癥，如炎癥反應等，提供可應用于生物醫學工程的ー種細胞片層智能脫附水凝膠，該水凝膠既具有良好的生物相容性，能促進細胞快速増殖，又具有優異的溫度或PH值響應性能，僅通過改變溫度或pH值凝膠便可快速在親水性和疏水性之間變化，從而實現細胞増殖和脫附的智能調控。本發明的ー種細胞片層智能脫附水凝膠，由功能単體Ml、化學或物理交聯劑M2和水溶性生物高分子M3溶于溶劑M4中采用氧化還原引發體系進行自由基聚合而成，所述的Ml、M2、M3 和 M4 的質量百分比為 Ml :8-15%, M2 :1-10%, M3 :1-15%, M4 :60-90%，改變溫 度或PH值后細胞從水凝膠表面脫附，形成片層結構。所述的Ml具有溫度敏感性或pH值敏感性，為N-異丙基丙烯酰胺或N，N’ -雙こ基丙烯酰胺或雙こ氧基丙烯酰胺或甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酯或丙烯酸或甲基丙烯酸或衣康酸中的ー種，以及其共混物。所述的M2是化學交聯劑或物理交聯劑，為N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺或ニ甲基丙烯酸こニ醇酯或哌臻丙烯酰胺或戊ニ醛或鋰皂石或鎂皂石或鋅皂石或硅酸鎂鋰中的ー種，以及其混合物。所述的M3是水溶性生物高分子，為淀粉或羧甲基纖維素鈉或海藻酸鈉或殼聚糖或腐植酸鈉或明膠或瓜兒膠或聚こ烯吡咯烷酮或β-環糊精或絲膠蛋白中的ー種，以及其混合物。所述的Μ4為去離子水。所述的水凝膠脫附細胞為小鼠成纖細胞或角膜細胞或骨骼肌細胞或骨髄間充質干細胞或皮膚纖維原細胞或人臍靜脈內皮細胞或大鼠胰島細胞或牙周膜干細胞中的ー種。所述的水凝膠在溫度為3_15°C或pH值為2-5時增殖的細胞從水凝膠表面迅速脫附，形成細胞片層。所述的水凝膠智能脫附后的細胞片層植入受區位點、通過同型或異型細胞片層的疊加而構建三維結構的組織。所述的水凝膠智能脫附后的細胞片層在皮膚、角膜上皮和牙周膜韌帶組織或器官的治療與修復中的應用。本發明的原理是溫敏或pH值響應水凝膠具有良好的溫度和pH值敏感性，在環境溫度分別高于或低于相轉變溫度或臨界PH值時，凝膠會發生親疏水的變化，其體積發生收縮或溶脹現象。高溫或低PH值時，由于疏水基團起主導作用或酸根離子質子化，凝膠宏觀表現為體積收縮，同時由于水凝膠含有生物相容性高分子，細胞在凝膠表面快速黏附、鋪展、増殖達到一定的數量后，將環境溫度降到相轉變溫度以下或環境PH值升到臨界pH值以上，這時凝膠體積膨脹，貼附在凝膠表面的細胞自動脫附，從而得到具有高活性的細胞片層，轉載至皮膚等組織缺損處可快速増殖。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果(I)本發明可用于細胞片層智能脫附的水凝膠成分簡單，操作方便，具有優良的溫度或PH值響應特性，以及生物相容性，可有效促進細胞的快速增殖和脫附。(2)水凝膠的細胞相容性和細胞増殖或脫附速率可通過單體投料比、交聯度和反應溫度等來調控。·(3)細胞片層脫附簡便易行，僅僅通過控制溫度或pH值就可以實現細胞的自動脫附，從而避免了傳統的酶解法對細胞活性、功能等造成的損傷。(4)獲得的細胞片層保留了完整細胞外基質，不需支架材料，通過相同或不同的細胞片層相互層疊而獲得全細胞的三維組織，克服了傳統組織工程支架降解的弊端，在牙周和皮膚組織再生等領域具有良好的應用前景。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進ー步詳細闡述。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，其他的任何未違背本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例Iー種細胞片層智能脫附水凝膠，由N-異丙基丙烯酰胺、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺和羧甲基纖維素鈉溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發體系進行自由基聚合而成，所述的異丙基丙烯酰胺、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、羧甲基纖維素鈉和去離子水的質量百分比為80%，降低水凝膠環境溫度為5°C，増殖7天的皮膚纖維原細胞從水凝膠表面脫附，形成片層結構。脫附后的皮膚纖維原細胞片層可用于燒燙傷皮膚表皮的治療與修復。實施例2—種細胞片層智能脫附水凝膠，由N-異丙基丙烯酰胺、鋰皂石和海藻酸鈉溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發體系進行自由基聚合而成，所述的異丙基丙烯酰胺、鋰皂石、海藻酸鈉和去離子水的質量百分比為11%，降低水凝膠環境溫度為4°C，増殖7天的角膜細胞從水凝膠表面脫附，形成片層結構。脫附后的角膜細胞片層可用于角膜的治療與修復。實施例3ー種細胞片層智能脫附水凝膠，由甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酷、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯和腐植酸鈉溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發體系進行自由基聚合而成，所述的甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酷、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯、腐植酸鈉和去離子水的質量百分比為8%，3%，4%，85%,降低水凝膠環境溫度為3°C，増殖7天的骨髓間充質干細胞從水凝膠表面脫附，形成片層結構。脫附后的骨髓間充質干細胞片層可用于硬皮病的治療與修復。實施例4
ー種細胞片層智能脫附水凝膠，由N，N’ -雙こ基丙烯酰胺、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯和聚こ烯吡咯烷酮溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發體系進行自由基聚合而成，所述的N，N’ -雙こ基丙烯酰胺、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯、聚こ烯吡咯烷酮和去離子水的質量百分比為10 %，4%，6 %，80%，降低水凝膠環境溫度為4°C，増殖7天的人臍靜脈內皮細胞從水凝膠表面脫附，形成片層結構。脫附后的人臍靜脈內皮細胞片層可用于心肌組織的治療與修復。實施例5ー種細胞片層智能脫附水凝膠，由異丙基丙烯酰胺和丙烯酸(質量比為3 I)的共混物、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺/鋰皂石的混合物和絲膠蛋白溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發體系進行自由基聚合而成，所述的異丙基丙烯酰胺和丙烯酸的共混物、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、絲膠蛋白和去離子水的質量百分比為12%，6%，12%，80%，降低水凝膠環境溫度為5°C，増殖7天的牙周膜干細胞從水凝膠表面脫附，形成片層結構。脫附后的牙周膜干細胞片層可用于牙周炎的治療與修復。 實施例6ー種細胞片層智能脫附水凝膠，由甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酯和甲基丙烯酸的共混物(質量比為4 I)、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和殼聚糖溶于去離子水中采用過硫酸氨/四甲基こニ胺引發體系進行自由基聚合而成，所述的甲基丙烯酸N，N- ニ甲氨基こ酯和甲基丙烯酸的共混物、N, N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、殼聚糖和去離子水的質量百分比為14%,8%, 3%, 75%,降低水凝膠環境溫度為3°C，増殖7天的皮膚纖維原細胞從水凝膠表面脫附，形成片層結構。脫附后的皮膚纖維原細胞片層可用于燒燙傷皮膚表皮的治療與修復。
權利要求
1.ー種細胞片層智能脫附水凝膠及其應用，其特征在于由功能単體Ml、化學或物理交聯劑M2和水溶性生物高分子M3溶于溶劑M4中采用氧化還原引發體系進行自由基聚合而成，所述的Ml、M2、M3和M4的質量百分比為Ml :8-15%, M2 :1-10%, M3M4 60-90%,改變溫度或pH值后細胞從水凝膠表面脫附，形成片層結構。
2.根據權利要求I所述的ー種細胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的Ml具有溫度敏感性或pH值敏感性，為N-異丙基丙烯酰胺或N，N’ -雙こ基丙烯酰胺或雙こ氧基丙烯酰胺或甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酯或丙烯酸或甲基丙烯酸或衣康酸中的ー種，以及其共混物。
3.根據權利要求I所述的ー種細胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的M2是化學交聯劑或物理交聯劑，為N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺或ニ甲基丙烯酸こニ醇酯或哌臻丙烯酰胺或戊ニ醛或鋰皂石或鎂皂石或鋅皂石或硅酸鎂鋰中的ー種，以及其混合物。
4.根據權利要求I所述的ー種細胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的M3是水溶性生物高分子，為淀粉或羧甲基纖維素鈉或海藻酸鈉或殼聚糖或腐植酸鈉或明膠或瓜兒膠或聚こ烯吡咯烷酮或β -環糊精或絲膠蛋白中的ー種，以及其混合物。
5.根據權利要求I所述的ー種細胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的Μ4為去離子水。
6.根據權利要求I所述的ー種細胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的水凝膠脫附細胞為小鼠成纖細胞或角膜細胞或骨骼肌細胞或骨髓間充質干細胞或皮膚纖維原細胞或人臍靜脈內皮細胞或大鼠胰島細胞或牙周膜干細胞中的ー種。
7.根據權利要求I所述的ー種細胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的水凝膠在溫度為3-15°C或pH值為2-5時增殖的細胞從水凝膠表面迅速脫附，形成細胞片層。
8.根據權利要求I所述的ー種細胞片層智能脫附水凝膠，其特征在于所述的水凝膠智能脫附后的細胞片層植入受區位點、通過同型或異型細胞片層的疊加而構建三維結構的組織。
9.根據權利要求I所述的ー種細胞片層智能脫附水凝膠及其應用，其特征在于所述的水凝膠智能脫附后的細胞片層在皮膚、角膜上皮和牙周膜韌帶組織或器官的治療與修復中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種細胞片層智能脫附水凝膠及其應用。所述水凝膠由功能單體M1、化學或物理交聯劑M2和水溶性生物高分子M3溶于溶劑M4中采用氧化還原引發體系進行自由基聚合而成，所述的M1、M2、M3和M4的質量百分比為M15-10％，M22-10％，M31-15％，M475-92％。該水凝膠具有優良的溫度或pH值響應特性，以及生物相容性，可有效促進細胞的快速增殖和脫附。脫附后形成的細胞片層保留了完整細胞外基質，避免了酶解法對細胞造成的生物學功能損傷和支架材料降解成分對細胞的傷害。本發明的水凝膠智能脫附后的細胞片層可用于皮膚、角膜上皮和牙周膜韌帶相關組織和器官的治療與修復。
文檔編號A61L27/52GK102718928SQ201210228270
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月4日 優先權日2012年7月4日
發明者張青松, 王小召, 董盼盼, 陳莉, 魯思 申請人:天津工業大學