專利名稱：用于預防或治療煙堿成癮的綴合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及煙堿衍生的半抗原、半抗原-間隔基綴合物和半抗原-載體綴合物，其作為抗煙堿疫苗中的抗原性組分。本發明也涉及用佐劑配制的含有所述煙堿衍生的半抗原-載體綴合物抗原的疫苗組合物。所述組合物用于提高戒煙和煙草/煙堿依賴性治療努力的戒煙率或減少復吸率。
背景技術：
吸煙對健康有許多嚴重的不良作用且由于許多減少或防止吸煙的政府倡議，吸煙已經變得越來越不為社會所接受。因此，每年有許多吸煙者希望戒煙，并同時作出嘗試，但只有少數完成戒煙者不復吸。非常高的失敗率是煙堿成癮性加上香煙容易取得的結果。隨著吸煙，或使用其他形式的煙堿(例如，竇道、貼片、口香糖)，煙堿進入血流中且之后迅速進入腦中，其在腦中刺激煙堿乙酰膽堿受體，造成多巴胺的釋放，其轉而活化獎賞中心。隨著戒煙嘗試，有獎賞(reward)反應的損失，以及包括認知功能下降的戒斷癥狀。復吸的主要原因是獎賞的損失和令人不快的戒斷癥狀可因吸煙而立即解除。 有各種用于戒煙的非疫苗療法。煙堿替代療法如含有煙堿的口香糖或皮膚貼片，可以幫助戒除吸煙者隔斷香煙，但他們不破壞煙堿導致成癮周期。另一種方法是使用針對煙堿乙酰膽堿受體的藥物，如伐尼克蘭。此類藥物，降低由吸煙通常遇到的獎賞，已比較成功地幫助戒煙，然而藥物治療結束之后復吸率都很高，因為失效(例如，吸單次煙)可以很容易地轉成完全復吸與再活化獎賞中心。最近的煙堿戒除戰略重點在于疫苗，其刺激免疫系統產生結合血液中的煙堿的抗煙堿抗體，從而減少煙堿可以進入腦的量和比率。這轉而防止獎賞中心被活化和幫助破壞成癮周期。因為由疫苗誘發的抗體可長期存活，所以抗煙堿疫苗對于協助戒煙以及預防復吸是有用的。此外，因為抗體作用于周邊，所以沒有中樞神經系統(CNS)副作用的風險。此類疫苗的實例描述于 WO 00/32239, WO 02/49667, WO 03/82329 和 US 2006/111271 中。煙堿衍生物描述于 EP-A-421762、WO 01/70730、WO 01/80844 和 US2005/119480 中。此外煙堿衍生物已確認為注冊號 136400-02-7、250683-10-4、861023-80-5 和 861025-04-9。煙堿半抗原描述于 WO 99/61054、WO 02/58635、WO 03/82329、WO 2005/40338 和 EP-A-1849780中。

發明內容
本發明涉及煙堿衍生的半抗原、半抗原-間隔基綴合物以及可用于制備免疫原性半抗原-載體綴合物的綴合方法，所述免疫原性半抗原-載體綴合物用于為了提高戒煙治療努力的戒煙率或降低復吸率而設計的疫苗。本發明也涉及含有上述綴合物以及佐劑或賦形劑的疫苗制劑，其用于免疫接種吸煙者以便引起針對所述半抗原的抗體，其轉而識別和特異性結合煙堿。本發明進一步涉及一種在戒煙治療努力中提高戒煙率或減少復吸率的方法，其包括將半抗原-載體綴合物給予希望戒煙的吸煙者。在其他實施方案中，疫苗可用于非吸煙者，以防止他們對煙堿上癮，如果他們隨后因吸煙或其他手段而暴露于煙中。本發明煙堿衍生的半抗原-載體綴合物的優點為它們比本領域中已知的煙堿衍生的半抗原-載體綴合物更具有免疫原性、更具特異性、更穩定、或具有其他更有用的性質。本發明煙堿衍生的半抗原-載體綴合物用于抗煙堿疫苗中可以為比其他已知煙堿衍生的半抗原-載體綴合物更具免疫原性的抗原。同樣，包含本發明煙堿衍生的半抗原-載體綴合物作為抗原以及佐劑的疫苗制劑可比其他其通常添加佐劑氫氧化鋁的抗煙堿疫苗制劑更具免疫原性，且導致依賴于煙堿/煙草和希望戒煙的患者較高戒煙率和較低復吸率。由于抗原內較好的固有免疫原性，以及通過佐劑增強，本發明的疫苗制劑也可更快速和用更少的劑量達成較高的抗煙堿抗體效價，相對于現有技術中已知的疫苗制劑，產生改良的順應性。
本發明煙堿衍生的半抗原化合物的合成路徑的優點為它們提供增加的總合成收率(優選增加總合成收率多達20倍)，包括合成步驟數的減少、導致所產生的煙堿衍生的半抗原的純度增加(例如>99%純度)或具有其他比現有技術中已知的合成路徑更有用的性質。


圖I顯示用包含本發明煙堿衍生的半抗原-綴合物與佐劑的疫苗免疫接種小鼠在不同的時間點對血漿中抗煙堿抗體水平的影響。通過肌肉內接種(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT ;IOyg)的煙堿衍生的半抗原(來自制備4、7、8和12)，在氫氧化鋁(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG24555 (含有免疫刺激 CpG 基序(motif)的 21-兀(mer) TLR9激動劑)(50 μ g)存在下，將BALB/c小鼠(η = 12每組)免疫接種。以ELISA測量血漿中的抗煙堿抗體水平(總IgG)。圖2顯示用含有包含本發明半抗原的綴合物抗原的抗煙堿疫苗免疫接種小鼠在不同的時間點對所產生的抗煙堿抗體在血漿中的親和性的影響。通過肌肉內接種(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT;10yg)的煙堿衍生的半抗原(來自制備4、7、8和12)，在氧氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將 BALB/c小鼠(η = 12每組)免疫接種。親和性指數對應于從煙堿-BSA涂覆板洗脫50%的抗煙堿抗體所需要的硫氰酸銨的濃度，且較高濃度的要求表示具有較高的親和性的抗體。圖3顯示用含有包含本發明半抗原的綴合物抗原的抗煙堿疫苗免疫接種小鼠對靜脈內(IV)給予的3H-煙堿在腦和血液中的分布的影響。通過肌肉內注射(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT;10yg)的煙堿衍生的半抗原(來自制備4、7、8和12)，在氫氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將 BALB/c 小鼠(n=6每組)免疫接種。在最后激發(boost) 2周之后,通過IV注射給予3H-煙堿(O. 05mg/kg煙堿，包含3 μ Ci3H-nic)，收集血液，灌注動物，取出大腦，定量3H的水平和測定3H的血漿/腦的比例。圖4顯示用得自本發明半抗原的疫苗免疫接種小鼠后與抗煙堿抗體的煙堿的相互作用。通過肌肉內接種(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT;10yg)的煙堿衍生的半抗原(來自制備4、7、8和12),在氫氧化招(alum ；Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和CpG24555 (50 μ g)存在下，將BALB/c小鼠(η = 12每組)免疫接種。在最后激發2周之后，以競爭ELISA證明抗煙堿抗體與煙堿之相互作用。圖5顯示用含有本發明半抗原的疫苗免疫接種小鼠之后抗煙堿抗體的特異性。通過肌肉內注射(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT;10yg)的煙堿衍生的半抗原(來自制備 4 和 12)，在氫氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將BALB/c小鼠(η = 12每組)免疫接種。在最后激發2周之后，抗煙喊抗體對對煙堿、可替寧、乙酰膽堿和伐尼克蘭的特異性以競爭ELISA測量。圖6顯示以使用不同間隔基將本發明煙堿衍生的半抗原綴合于載體的抗煙堿疫苗免疫接種的小鼠在不同的時間點對血漿中的抗煙堿抗體水平的影響。通過肌 肉內注射(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT;10yg)且綴合物使用不同接頭(制備24-34)的煙堿衍生的半抗原(制備4;5’氨基丙基煙堿)，在氫氧化鋁(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將 BALB/c 小鼠(η = 12 每組)免疫接種。以ELISA測量血漿中的抗煙堿IgG Ab水平。圖7顯示以使用不同間隔基將本發明煙堿衍生的半抗原綴合于載體的抗煙堿疫苗免疫接種的小鼠對血漿中抗煙堿抗體的水平和親和性及對血漿和腦中3H-煙堿的分布的影響。通過肌肉內接種(在第0、28、42天)用綴合于白喉類毒素(DT;10yg)且綴合物使用不同接頭(制備24-34)的煙堿衍生的半抗原(制備4;5’氨基丙基煙堿)，在氫氧化鋁(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將 BALB/c 小鼠(η = 12 每組)免疫接種。在第三次免疫接種2周之后，以ELISA測量血漿中的抗煙堿IgG Ab水平及以硫氰酸銨分析測量親和性。通過IV注射給予3H-煙堿(O. 05mg/kg煙堿包含3 μ Ci3H_nic)，收集血液，灌注動物，取出大腦，定量3H的水平和測定3H的血漿/腦的比例。圖8顯示以使用不同間隔基將本發明煙堿衍生的半抗原綴合于載體的抗煙堿疫苗免疫接種的小鼠在不同的時間點對血漿中抗煙堿抗體的水平的影響。通過肌肉內接種(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT;10yg)且綴合物使用不同接頭(制備24-34)的煙堿衍生的半抗原(制備12 ;5’氨基乙氧基煙堿)，在氫氧化鋁(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將 BALB/c 小鼠(η = 12 每組)免疫接種。以ELISA測量血漿中的抗煙堿抗體水平(總IgG)。圖9顯示以使用不同間隔基將本發明煙堿衍生的半抗原綴合于載體的抗煙堿疫苗免疫接種的小鼠對血漿中抗煙堿抗體的水平和親和性及對血漿和腦中3H-煙堿的分布的影響。通過肌肉內接種(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT;10yg)且綴合物使用不同接頭(制備24-34)的煙堿衍生的半抗原(制備12;5’氨基乙氧基煙堿)，在氫氧化鋁(alum;Alhydrogel-85:40y gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將 BALB/c 小鼠(η =12每組)免疫接種。在第三次免疫接種2周之后，以ELISA測量血漿中的抗煙堿IgG Ab水平及以硫氰酸銨分析測量親和性。通過IV注射給予3H-煙堿(0.05!1^/1^煙堿，包含3 4以3H-nic)，收集血液，灌注動物，取出大腦，定量3H的水平和測定3H之血漿/腦的比例。圖10顯示本發明半抗原-載體綴合物的丁二酰化在不同的時間點對血漿中抗煙堿抗體水平的影響。通過肌肉內接種(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT;IOug)且綴合物使用2種不同條件制備(各為有或沒有丁二酸酐步驟)的煙堿衍生的半抗原(制備4;5’氨基丙基煙堿)，在氫氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和CpG24555 (50 μ g)存在下，將BALB/c小鼠(η = 12每組)免疫接種。以ELISA測量血漿中的抗煙堿抗體水平(總IgG)。
圖11顯示本發明半抗原-載體綴合物的丁二酰化對3H-煙堿在血液和腦中的分布的影響。通過肌肉內接種(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT;10yg)且綴合物使用2種不同條件制備(各為有或沒有丁二酸酐步驟)的煙堿衍生的半抗原(制備4 ;5’氨基丙基煙堿)，在氫氧化招(alum; Alhydroge 1-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將BALB/c小鼠(n= 12每組)免疫接種。在最后激發2周之后，通過IV注射給予3H-煙堿(0.0511^/1^煙堿，包含311(^ 3H-niC)，收集血液，灌注動物，取出大腦，定量3H在腦和血漿中的水平。圖12顯示以使用不同間隔基將本發明煙堿衍生的半抗原綴合于載體的抗煙堿疫苗免疫接種的小鼠在不同的時間點對血漿中抗煙堿抗體水平的影響。通過肌肉內接種(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT5IOyg)或CRM197(IOyg)且綴合物使用不同接頭(制備24-34)的煙堿衍生的半抗原(制備12;5’氨基乙氧基煙堿)，在氫氧化鋁(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將 BALB/c 小鼠(η = 12 每組)免疫接種。以ELISA測量血漿中的抗煙堿抗體水平(總IgG)。圖13顯示用抗煙堿疫苗免疫接種的小鼠對3H-煙堿在小鼠中的分布的影響。通過肌肉內接種(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT;10yg)或CRM197 (10 μ g)的煙堿衍生的半抗原(制備12 ;5’氨基乙氧基煙堿)，在氫氧化鋁(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將 BALB/c 小鼠(η = 12 每組)免疫接種。在第三次免疫接種二周之后，通過IV注射給予3H-煙堿(O. 05mg/kg煙堿，包含3 μ Ci 3H-niC)，收集血液，灌注動物，取出大腦，定量3H的水平和測定相對于對照組動物的3H-煙堿在腦中的％改變。圖14顯示用抗煙堿疫苗免疫接種的小鼠在不同的時間點對血漿中的抗煙堿抗體水平的影響。通過肌肉內接種(在第0、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT;10yg)或CRM197(IOyg)的煙堿衍生的半抗原(制備12 ;5’氨基乙氧基煙堿)，在氫氧化鋁(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將 BALB/c 小鼠(n=12 每組)免疫接種。評估不同半抗原裝載的范圍。以ELISA測量血漿中的抗煙堿抗體水平(總IgG)。圖15顯示用抗煙堿疫苗免疫接種的小鼠對小鼠中的3H-煙堿分布的影響。通過肌肉內接種(在第O、28、42天)，用綴合于白喉類毒素(DT ；10μ g)或CRM197 (10 μ g)的煙堿衍生的半抗原(制備12 ;5’氨基乙氧基煙堿)，在氫氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和CpG 24555 (50 μ g)存在下，將BALB/c小鼠(η = 12每組)免疫接種。評估不同半抗原裝載的范圍。在第三次免疫接種二周之后，通過IV注射給予3H-煙堿(0.05mg/kg煙堿，包含3 μ Ci3H-nic)，收集血液，灌注動物，取出大腦，定量3H的水平和測定相對于對照組動物的3H-煙堿在腦中的％改變。圖16-18顯示用抗煙堿疫苗免疫接種的小鼠在不同的時間點對血漿中的抗煙堿抗體水平和親和性的影響。通過肌肉內接種，用綴合于CRM197(IOyg)的煙堿衍生的半抗原(制備12;5’氨基乙氧基煙堿)，在氫氧化鋁(alum;Alhydrogel-85:40y gAl3+)和CpG24555 (50 μ g)存在下或者在 ISC0MATRIXaMX;0. 1-3. O 單位)存在下，將 BALB/c 小鼠(η =10每組)免疫接種。以ELISA (第21和28天)測量血漿中的抗煙堿抗體水平(總IgG)和以抑制ELISA測量親和性。圖16 [i]顯示第I次劑量3周后的結果；且[ii]顯示示第2次劑量I周后的結果。圖17顯不在弟_■次劑量一周后的未和性(IC5tl)。圖18顯不煙喊在血漿中的螯合(上)；煙堿吸收于腦中(下)。圖19和20顯示表6的煙堿衍生的半抗原-載體綴合物的綴合條件對抗煙堿抗體水平和對應IC5tl值的影響。通過肌肉內接種，用煙堿衍生的半抗原，在氫氧化鋁(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，將 BALB/c 小鼠(η = 10 每組)免疫接種。以ELISA測量血漿中的抗煙堿抗體水平(總IgG)和以抑制ELISA測量親和性。圖21和22顯示對于表6的半抗原-載體綴合物的3H-煙堿在血液和腦中的分布。通過肌肉內接種，用煙堿衍生的半抗原，在氫氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和CpG 24555 (50 μ g)存在下，將BALB/c小鼠(η = 10每組)免疫接種。在第二次免疫接種一周之后，通過IV注射給予3H-煙堿(0.0511^/1^煙堿，包含311(^ 3H_nic)，收集血液，灌注動 物，取出大腦，定量3H的水平和測定相對于對照組動物的3H-煙堿在血液和腦中之％改變。圖23顯示測試具有不同百分比單體載體蛋白的半抗原-載體綴合物結合于CpG/Alhydrogel的結果。通過用已知量的半抗原-載體綴合物溫育CpG/Alhydrogel,然后測量溫育后留在溶液的綴合物濃度來測定結合。綴合物濃度的％減少等同于結合至CpG/Alhydrogel的％綴合物。通過肌肉內注射,用10 μ g不同綴合物將BALB/c小鼠(η = 10每組)在氫氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和10 μ gCpG 24555存在下免疫接種。在第二次免疫接種一周之后，通過IV注射給予3H-煙堿(O. 05mg/kg煙堿，包含3 μ Ci3H_nic)，收集血液，灌注動物，取出大腦，定量3H的水平和測定相對于對照組動物的3H-煙堿在血液和腦中的％改變。序列表SEQ ID NO: I為免疫刺激寡核苷酸ODN CpG 24555的核苷酸序列。
具體實施例方式在一方面中，本發明涉及式(I)的半抗原
X, η ΓΛ
、5 W2 GH3
(I)其中W 為-CH2-或-O-;且 X 為-NH2 或-SH。在一實施方案中，W位于吡啶環的位置2、5或6。在另一實施方案中，W位于吡啶環的位置5。在另一實施方案中，W為-O-。在另一實施方案中，W為-O-;且W位于吡啶環的位置5。在一另外實施方案中,所述半抗原為
權利要求
1.式⑴的半抗原
2.權利要求I的半抗原，其中W位于吡啶環的位置2、5或6。
3.權利要求I或2的半抗原，其中W為-O-且W位于吡啶環的位置5。
4.權利要求I或2的半抗原，其中所述半抗原選自
5.式(II)的半抗原-間隔基綴合物
6.權利要求5的半抗原-間隔基綴合物，其中X為-SH。
7.權利要求5的半抗原-間隔基綴合物，其中X為-NH2。
8.權利要求5-7中任一項的半抗原-間隔基綴合物，其中_(間隔基)_為C1-C8亞烷基。
9.權利要求5-8中任一項的半抗原-間隔基綴合物，其中W為-O-;且W位于吡啶環的位置5。
10.式(III)的半抗原-載體綴合物
11.權利要求10的半抗原-載體綴合物，其中W位于吡啶環的位置2、5或6。
12.權利要求10或11的半抗原-載體綴合物，其中W為-O-，且W位于吡啶環的位置5。
13.權利要求12的半抗原-載體綴合物，其中m為0，且X*為-NH-。
14.權利要求10-13中任一項的半抗原-載體綴合物，其中所述載體蛋白為任選地修飾的蛋白，所述蛋白選自破傷風毒素的衍生物(例如，化學失活的破傷風類毒素)、白喉毒素的衍生物(例如，化學失活的白喉類毒素或無毒遺傳突變體CRM197)、匙孔血藍蛋白(KLH)、血藍蛋白、來自腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白復合物(OMPC)、不耐熱大腸桿菌毒素的B亞基、來自綠膿桿菌的重組胞外蛋白A(rEPA)以及其他病毒樣顆粒如由噬菌體Qb的重組外殼蛋白、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原或病毒體組裝的病毒樣顆粒。
15.權利要求10-14中任一項的式(III)的半抗原-載體綴合物，其中所述載體為任選地修飾的蛋白，所述蛋白選自白喉類毒素和CRM197。
16.權利要求10-15中任一項的式(III)的半抗原-載體綴合物，其中所述載體蛋白為修飾的丁二酰化的蛋白。
17.權利要求10-16中任一項的半抗原-載體綴合物，其中η為10-18范圍內的整數，包括10和18。
18.疫苗組合物，其包含多種權利要求10-17中任一項的半抗原-載體綴合物；以及一種或多種佐劑。
19.權利要求18的疫苗組合物，其中所述一種或多種佐劑中的一種為CpG24555。
20.權利要求18的疫苗組合物，其中所述一種或多種佐劑中的一種為鋁鹽。
21.權利要求20的疫苗組合物，其中所述鋁鹽為氫氧化鋁。
22.權利要求21的疫苗組合物，其中所述佐劑為CpG24555和氫氧化鋁。
23.權利要求20的疫苗組合物，其中所述一種或多種佐劑中的一種為免疫刺激復合物(ISCOM)。
24.權利要求23的疫苗組合物，其中所述免疫刺激復合物為ISC0MATRIX。
25.疫苗組合物，其包含CpG24555和多種式(IV)的半抗原-載體綴合物
26.疫苗組合物，其包含CpG24555、氫氧化鋁和多種式(IV)的半抗原-載體綴合物
27.疫苗組合物，其包含ISC0MATRIX和多種式(IV)的半抗原-載體綴合物
28.權利要求25-27中任一項的疫苗組合物，其中η為10-18范圍內的整數，包括10和18。
29.權利要求18-28中任一項的疫苗組合物，其中至少70%的所述多種半抗原-載體綴合物包含不為高分子量物質的載體蛋白(Y)。
30.權利要求10-17中任一項的半抗原-載體綴合物或者權利要求18-29中任一項的疫苗組合物，其用作藥物。
31.權利要求10-17中任一項的半抗原-載體綴合物或者權利要求18-29中任一項的疫苗組合物，其用于增加希望戒煙的吸煙者的戒煙率和減少已通過接種抗煙堿疫苗或以前用藥物療法進行治療或自我戒煙而成功地戒煙的曾經吸煙者的復吸率；或者用于治療或預防有需要的人的煙堿依賴性。
32.幫助希望戒煙的吸煙者戒煙或預防已通過接種抗煙堿疫苗或以前使用藥物療法進行治療或自我戒煙而成功地戒煙的曾經吸煙者復吸，或者預防有需要的人的煙堿依賴性的方法，所述方法包括將權利要求18-29的疫苗組合物給予所述人。
全文摘要
本發明部分地涉及式(III)的煙堿衍生的半抗原-載體綴合物，其中m、n、W、-(間隔基)-、X*和Y如說明書中所定義。在某些實施方案中，所述煙堿衍生的半抗原-載體綴合物可用于制備用于治療和/或預防煙堿成癮的疫苗。
文檔編號A61P25/30GK102933237SQ201180027358
公開日2013年2月13日 申請日期2011年6月3日 優先權日2010年6月4日
發明者N·阿納斯塔西奧, K·巴塔查里亞, A·D·布朗, H·L·戴維斯, J·I·芬內曼, D·P.·熱爾韋, L·H·約內斯, P·A·科爾, M·J·麥克拉斯基, P·R·梅海里克, J·R·默森, E·K·帕森斯, D·C·普賴德, D·R·斯特德, J·M·特恩 申請人:輝瑞疫苗有限責任公司