專利名稱：一種hiv-1脂質體疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物預防醫藥領域，具體涉及一種預防艾滋病的HIV-I脂質體疫苗的制備。
背景技術：
艾滋病是全球所面臨的最重大挑戰之一，嚴重危害社會進步與經濟增長，已造成 6000多萬人被感染，其中3000萬人已經死亡，目前存活的感染者約為3320萬，其中90%以上的病例發生在發展中國家。至今為止，在各國政府與國際組織強有力的支持下，世界上先后開展了 100多個臨床試驗，但尚未有一個成功上市的艾滋病疫苗。艾滋病疫苗研制困難的一個主要原因是由于艾滋病病毒的特殊性，即HIV-I具有高度的變異性。以往的疫苗所選擇的抗原表位主要是自然感染中的優勢抗原表位，而這些抗原表位是HIV-I中變異頻率最高的位點。因此， 以這些抗原構建的疫苗誘導出的抗體具有延遲性，無法中和已經發生突變的HIV-I。通過保守免疫原設計來誘導具有廣譜保護作用新疫苗是解決現有艾滋病疫苗研究中所存在的問題一個重要研究方向。高度保守的HIV-I gp41 MPER被認為是最具潛力的中和抗體設計靶點。目前為止分離得到的五個廣泛中和抗體有三個(2F5，4E10和Z13抗體)是識別該區域的，其中4E10 能以較低的濃度中和HIV-I原始病毒株在內22株病毒株的全部亞型病毒，2F5可中和大約 67%左右的病毒。但是，無論在真核還是原核表達系統表達gp41或截短的gp41片段作為抗原時，由于獲得的蛋白溶解性較差，很難產生相應的抗體。

發明內容
本發明的目的是提供了一種用于預防艾滋病的HIV-I脂質體疫苗。本發明將HIV-I gP41的MPER段較保守的抗原核心表位共價偶聯到脂質體表面， 模擬HIV病毒env的天然狀態，同時在抗原序列中加入通用的輔助性T細胞表位，通過B、T 細胞雙信號識別，有助于增強機體對抗原的免疫應答，并能產生廣譜的保護作用。其中HIV-I gP41的MPER段較保守的抗原核心表位包括但不限于4E10和/或2F5 所識別的核心表位，抗原序列中加入通用的輔助性T細胞表位包括但不限于破傷風毒素 830-843序列和/或口蹄疫病毒VPI上200-213序列。經豚鼠免疫實驗，檢測到較高滴度的針對HIV-I gP41的MPER的抗體，并具有一定的中和活性。


圖1為本發明脂質體與抗原表位肽共價偶聯反應示意圖。馬來酰亞胺活化的磷脂在PH中性條件下與抗原表位肽的巰基發生邁克爾加成，從而將脂質體與抗原偶聯。
具體實施例方式下面結合實例對本發明進一步說明。實施例1抗原表位的設計選取HIV-I gp41 MPER上的4E10和/或2F5識別表位作為B細胞表位，加入通用 T細胞輔助表位，中間以6-氨基己酸連接。ELLELDKWASL-Ahx-QYIKANSKFIGITEC(Pl1)；ELLELDKffASL-Ahx-AKFVAAffTLKAAAC(P12)；SLNWFNITNWL-Ahx-QYIKANSKFIGITEC(P21)；SLNWFNITNWL-Ahx-AKFVAAffTLKAAAC(P22)；NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-Ahx-QYIKANSKFIGITEC(P31)；NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-Ahx-AKFVAAffTLKAAAC(P32)。實施例2HIV-I脂質體疫苗的制備利用薄膜分散法、反相蒸發法、乙醇注入法、凍干重建法等常用脂質體制備方法制備空白脂質體，脂質體膜材中加入馬來酰亞胺活化的磷脂或其他脂溶性物質。在PH 中性條件下與抗原表位肽的巰基發生邁克爾加成，從而將脂質體與抗原偶聯，反應原理如圖1所示。以二油脂酰乙酰膽堿膽固醇心磷脂馬來酰亞胺活化磷脂酰乙醇胺 (P0PC Chol CL MPB-PE) = 8 10 1 1(摩爾比)制備脂質體，將Pll加入上述空白脂質體，Pll 脂類的重量比為1 20，pH 6.6 6.7、4°〇攪拌1釙得？11脂質體疫苗 (Liposome Pll)。相同方法制備P12脂質體疫苗(Liposome P12)。GFC、RP_HPLC檢測偶聯率，結果顯示約50%的ft·偶聯到脂質體上。實施例3HIV-I脂質體疫苗的豚鼠免疫實驗實驗分5組，每組豚鼠5只。組1 弗式佐劑空白；組2 =Pr+弗式佐劑；組3 空白脂質體+MPL佐劑空白；組4:LipOSOme I^r+MPL佐劑。豚鼠皮下(四肢)多點注射，初免后每隔15天加強1次，0. 5ug/g體重。初免及加強采用Liposome Pll和Liposome P12 交替進行，四免后心臟取血檢測針對MPER的抗體產生情況，根據抗體效價進行中和活性評價。結合抗體檢測流程SA包被well — BSA封閉一bio-MPER —待測血清一羊抗豚鼠 IgG-HRP — TMB — 2MH2S04 — OD450。針對MPER的抗體產生情況見表1?？贵w中和活性評價見表2。表1
權利要求
1.一種HIV-I脂質體疫苗，其特征在于脂質體表面共價鍵偶聯HIV-lgP41的MPER段較保守的抗原核心表位，同時在抗原序列中加入通用的輔助性T細胞表位。
2.根據權利要求1所述的HIV-I脂質體疫苗，其特征在于所述HIV-IgP41的MPER段較保守的抗原核心表位包括但不限于4E10和/或2F5所識別的核心表位。
3.根據權利要求1所述的HIV-I脂質體疫苗，其特征在于所述抗原序列中加入通用的輔助性T細胞表位包括但不限于破傷風毒素830-843序列和/或口蹄疫病毒200-213序列。
4.根據權利要求1所述的HIV-I脂質體疫苗，其特征在于所述脂質體的膜材包括但不限于心磷脂、神經鞘磷脂、腦磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、膽固醇、飽和及不飽和的磷脂酰膽堿、馬來酰亞胺活化的磷脂或其他脂溶性物質。
5.根據權利要求1-4所述的HIV-I脂質體疫苗，其特征在于所述脂質體的的制備方法包括薄膜分散法、反相蒸發法、乙醇注入法、凍干重建法。
6.根據權利要求1-5所述的HIV-I脂質體疫苗，其特征在于脂質體粒徑為 10nm-50μ m。
7.權利要求6中的HIV-I脂質體疫苗可用于肌肉注射、皮下注射、皮內注射、腹腔注射、 口服給藥、肺部給藥、鼻腔給藥、口腔給藥、陰道肛門給藥。
8.權利要求7中的HIV-I脂質體疫苗在初免及加強免疫過程中可采用同種抗原核心表位-輔助T細胞表位，也可以同種抗原核心表位-不同輔助T細胞表位交替進行免疫。
全文摘要
具體涉及一種預防艾滋病的HIV-1脂質體疫苗的制備。本發明通過共價鍵將HIV-1gP41的MPER段較保守的抗原核心表位偶聯到脂質體表面，模擬HIV病毒env的天然狀態，同時在抗原序列中加入通用的輔助性T細胞表位，通過B、T細胞雙信號識別，有助于增強機體對抗原的免疫應答，并能產生廣譜的保護作用。
文檔編號A61K39/21GK102485273SQ20101056768
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月1日 優先權日2010年12月1日
發明者孔維, 張勇, 董慶光, 陳妍 申請人:吉林大學