專利名稱：殼聚糖載辣椒素微球制備方法及微球和減肥降脂以及降糖應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥和保健品食品技術領域，具體涉及一種殼聚糖載辣椒素微球 (CTS-CAP-MP)的制備方法及微球和在減肥、降血脂以及降血糖方面的應用。
背景技術：
殼聚糖(Chitosan，CTS)是一種天然聚陽離子多糖衍生物，大量存在于海洋節肢動物(蝦、蟹等)的甲殼中，也存在于低等動物菌類、昆蟲、藻類細胞膜中，資源十分豐富，目前CTS通常都是作為制備其他藥物微粒的壁材或者輔料使用。辣椒素(Capsaicin，CAP)是一種天然的植物堿，是由茄科植物辣椒的成熟果實中提取得到的有效成分，主要用于鎮痛、止癢，其鎮痛作用與嗎啡等同，但較嗎啡作用持久。目前對辣椒堿的應用研究均為直接應用，但是CAP的強烈刺激性影響了其應用， 未見利用CTS作為負載辣椒素的壁材或者輔料的技術報道，也未見采用CTS載CAP達到相關協同增效作用的技術報道。

發明內容
本發明的一個目的是填補現有技術的不足，提供一種CTS-CAP-MP的制備方法，成功實現CTS載CAP，制備得到包封率和載藥量俱佳的微球。本發明的另一個目的是提供所述方法制備得到的CTS-CAP-MP，本發明通過采用適宜的制備技術方案和工藝條件，所述微球成功利用CTS的載體作用，實現對CAP的二次包覆，很好地掩蓋CAP的刺激性，并克服單一物質效果有限、使用劑量大的局限性。本發明還有一個目的是提供所述微球的應用，發揮CTS和CAP協同增效作用。本發明的目的通過以下技術方案予以實現提供一種CTS-CAP-MP的制備方法，通過離子交聯法聯合噴霧干燥法制備得到，具體包括以下步驟(1)采用醋酸溶液充分溶解CTS，配制成1. Omg/ml的CTS溶液；采用吐溫-80 (Tween-80)溶液溶解CAP，配制成1. 5mg/ml的CAP溶液；(2)將步驟(1)所述CTS溶液和CAP溶液按照10 1的體積比混勻得混合溶液；(3)將三聚磷酸鈉(TPP)水溶液加入步驟( 所述混合溶液中得CTS-CAP-MP混懸溶液；所述TPP水溶液的用量優選按照CTS和TPP的質量比為4 1確定；(4)將步驟( 所述CTS-CAP-MP混懸溶液，放置至無氣泡，用噴霧干燥機進行噴霧干燥。優選地，本發明方法包括以下步驟(1)采用1 % (體積比濃度)的醋酸溶液充分溶解CTS，配制成1. Omg/ml的CTS溶液；采用0. 5%的Tween-80溶液(Tween-80與水的質量體積比為0. 5g/100ml)溶解CAP,配制成1. 5mg/ml的CAP溶液；(2)將步驟(1)所述CTS溶液和CAP溶液按照10 1的體積比混勻得混合溶液； 調節混合溶液PH值為4.5;(3)在攪拌下，將濃度為1 %的TPP水溶液(TPP和水的質量體積比為Ig 100ml) 恒速滴入步驟( 所述混合溶液中，至藍色乳光出現，繼續攪拌即得CTS-CAP-MP混懸溶液； 所述TPP水溶液的用量按照CTS和TPP的質量比為4 1確定(指的是CTS溶液和TPP中的化合物CTS和化合物TPP的質量比為4 1，下同)；(4)將步驟( 所述CTS-CAP-MP混懸溶液，放置至無氣泡，用噴霧干燥機進行噴霧干燥；步驟(4)所述噴霧干燥的工藝條件優選為熱風量32m3/h，進樣速率400ml/h，壓縮空氣壓力101/min，進風口的溫度為160°C，進樣速率為600ml/h。本發明經過長期大量的實驗結合創造性的分析和總結，綜合考慮多種因素及因素之間的相互影響，對離子交聯法和噴霧干燥工藝條件進行優化，通過確定CTS溶液和CAP溶液濃度、二者混合溶液的體積比和酸堿度、噴霧干燥的工藝條件等，成功實現CTS載CAP，制備得到包封率和載藥量俱佳的微球。本發明提供采用上述方法制備得到的CTS-CAP-MP，所述微球外觀呈球形，粒徑分布在0. 8 μ m 4. 5 μ m，平均包封率和載藥量分別為85. 17%和8. 87%，技術效果穩定。本發明創造性地采用高效液相色譜法測定CTS-CAP-MP中的CAP包載量，具有較好的重復性、穩定性和良好的進樣精密度，為CTS-CAP-MP的制備提供了針對性的檢測技術方案，控制穩定的產品質量。本方法CAP的檢測限(S/N > 3)為0. 08 μ g，定量限(S/N ^ 10) 為 0. 24 μ g0所述檢測方法包括以下步驟(A)制備CTS-CAP-MP混懸溶液(參見前述步驟(1) 步驟(3))；(B)將步驟㈧所述混懸溶液離心取上清液，調pH值至7. 0后沉淀未被包載的 CTS ；離心取上清液水浴蒸干，加入甲醇復溶后采用0. 22 μ m濾膜過濾，濾液進行高效液相色譜法測定。其中，所述高效液相色譜法的條件是色譜柱為DiamonsilC18 (250mmX4. 6mm，5 μ m)，流動相為體積比 68 32 的甲醇-水，紫外檢測波長為281nm，流速為1. Oml/min，柱溫為30°C，進樣量為20 μ 1。本發明提供了所述微球以下相關應用所述微球具有優良的緩釋性能，在pH值為7. 4的中性介質中，CTS-CAP-MP的藥物釋放較慢，且在24h基本釋放完全，可很好地應用于制備緩釋制劑方面。本發明制備得到的微球，CTS不僅僅作為CAP的有效載體，制備得到的微球在制備減肥、控制體重和降血脂、降血糖方面的藥物及保健品方面具有很好的新應用，尤其是在減肥、控制體重和降血糖方面， CTS與CAP共同發揮有效的協同增效作用。本發明的有益效果是(1)現有技術未見采用CTS作為CAP載體制備CAP微球的技術報道。本發明克服了技術難題，應用CTS作為載體，成功負載CAP，實現對CAP的二次包裹，使得CTS和TPP 通過化學鍵牢固地結合并通過二次包裹作用將CAP包載其中，平均包封率和載藥量分別為85. 17%和8. 87%。顯著減小CAP刺激性，提高了其順應性。(2)本發明在成功應用CTS作為CAP的載體的基礎上，在成功完成負載并實現二次包覆的同時，進一步對CTS溶液和CAP溶液濃度、二者混合溶液的體積比和酸堿度、具體的工藝條件等進行探索和優化，實現了微球良好的緩釋機制和兩種藥物的協同增效作用，所述微球在制備緩釋制劑、在制備減肥、控制體重和降血脂、降血糖方面的藥物及保健品方面具有良好的應用前景。(3)現有的載藥微球的制備，存在著制備過程中使用有機溶劑且制備產出量太少， 包封率和載藥量不佳等缺陷，不具有實際應用意義。本發明尋找適宜的制備方法和工藝條件，克服傳統制備載藥微球的技術不足，尤其是產量不足和制備過程中使用有機溶劑、包封率和載藥量不佳等不足，通過針對性改進離子交聯法聯合噴霧干燥技術，對CAP實現離子交聯和噴霧干燥過程中的二次包裹作用，實現大量生產，解決了 CTS和CAP實際應用的技術難題。(4)本發明創造性地采用高效液相色譜法測定CTS-CAP-MP中的CAP包載量，具有較好的重復性、穩定性和良好的進樣精密度，CAP的檢測限(S/N > 3)為0. 08 μ g，定量限 (S/N彡10)為O.Myg。本方法為微球的制備提供了一種可行的檢測方法，并有望成為有效的微球制備的質量控制方法，保證了本發明技術方案的完整及科學性，填補了本技術領域的空白，為微球制備技術的發展提供技術基礎。(5)本發明的制備方法簡單有效，工藝條件確定，具有很好的工業推廣實用性和價值。


圖1 CAP、CTS和TPP的紫外全波長掃描圖；圖2 CAP標準品HPLC色譜圖；圖3 CAP樣品HPLC色譜圖；圖4專屬性HPLC色譜圖(1.陰性對照、2. CAP樣品、3. CAP標準品)；圖5 CAP的標準曲線；圖6 CTS濃度對包封率的影響；圖7 TPP濃度對包封率的影響；圖8 CAP濃度對包封率的影響；圖9 CTS/TPP質量比對包封率的影響；圖10 pH值對藥物包封率的影響；圖 11 TPP、CTS、CAP、CTS+CAP+TPP 物理混合物、CTS_MP(殼聚糖微球)和 CTS-CAP-MP 的 DTA 分析圖；圖12 CTS-CAP-MP的粒徑分布圖；圖 13 CTS-CAP-MP 的 Zata 電位分布圖；圖 14 CTS-CAP-MP 的 SEM 圖(1000 倍)；圖15 CAP在不同介質中的累積釋放率；圖16體外吸附油脂實驗結果；圖17體外吸附膽固醇實驗結果；
圖18體外吸附膽酸鹽實驗結果；圖19體外吸附游離脂肪酸實驗結果。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例進一步說明本發明，本發明實施例中使用以下試劑和儀器，常規的物質或儀器的簡單替代也不能在此一一贅述，不能將本發明長期所做的大量實驗全部在此一一列舉，但并不因此限定本發明的范圍。JB-3型定時磁力攪拌器(上海智光儀器儀表有限公司)，十萬分之一電子分析天平(BT125D，德國賽多利斯)，ZetasizerNarK^S90粒度分析儀(英國馬爾文公司)，高效液相色譜儀(Ultimae 3000，美國戴安公司)，C18色譜柱(Diamonsil，北京迪馬科技有限公司)，保護預柱(KJ0-4^2，廣州菲羅門科學儀器有限公司)，ELGA超純水機(法國威立雅水處理技術有限公司)，鎢絲燈掃描電鏡(S3700N，日本日立公司)，差熱分析儀(ZR-2CR，南京多助科技有限公司)，高速離心機(TGL-16C，上海安亭科學儀器廠)，紫外可見分光光度計 (SPECORD S600，德國耶拿分析儀器股份公司)，pH計(MarterfC，美國奧豪斯儀器公司)， 0. 22有機相濾膜(天津津騰實驗設備有限公司)，0. 22水相濾膜(天津津騰實驗設備有限公司)，雙頻數控超聲波清洗器(KQ-500VDE，昆山市超聲儀器有限公司)，Thermo超低溫冰箱(702，美國賽默飛世爾科技公司)，噴霧干燥機(L-117，北京來亨科貿有限責任公司)，低速離心機(SC-3160，科大創新股份有限公司中佳分公司)，旋轉蒸發器(RE-5205，上海亞榮生化儀器廠)，電熱恒溫水槽(DK-8D，上海一恒科技有限公司)，鼓風干燥箱(DHG-9M6A，上海精密實驗設備有限公司)。辣椒素原料藥(純度> 95%，批號20100820，武漢圣天宇科技有限公司)，辣椒素對照品(純度> 98. 0%，批號10031121，上海同田生物技術有限公司)，吐溫_80(批號 20090201，廣州試劑廠)，色譜甲醇(美國霍尼韋爾公司)，甲醇(AR，天津百世化工有限公司)，殼聚糖(批號090320A，山東奧康生物科技有限公司)，多聚磷酸鈉(批號20100302， 天津福晨化學試劑廠)，冰醋酸(批號20090820，天津福晨化學試劑廠)。實施例1 CTS-CAP-MP的制備和檢測實驗1. CAP最大吸收波長的確定在190 800nm波長范圍內對CAP、CTS和TPP進行全波長掃描，選擇測定CAP的最佳吸收波長以減小輔料的干擾。附圖1為CAP、CTS和TPP的紫外全波長掃描圖，其中曲線1、2和3分別代表CAP、TPP和CTS的紫外全波長掃描圖。從附圖1中發現CAP在239nm 和^lnm具有較強的紫外吸收且CTS和TPP在該波長處紫外吸收很小，經過分析和總結，同時為了避免末端吸收的影響，故選擇CAP的紫外吸收測定波長為281nm。2.離子交聯法制備CTS-CAP-MP稱取CTS 0. IOg用體積比濃度為1 %的醋酸溶液充分溶解，配制成1. Omg/ml的 CTS 溶液。稱取 CAP 0. 15g 用 0. 5% 的 Tween-80 水溶液(Tween-80 水=0. 5g 100ml) 超聲8min增溶CAP，配制成1. 5mg/ml的CAP溶液。量取IOml CTS溶液于燒杯中，加入Iml CAP溶液，磁力攪拌15min混勻，加入4mol/l的NaOH調節混合溶液的pH值為4. 5 ；用注射器吸取濃度為的TPP溶液，在不斷攪拌(600r/min)的情況下，用4號針頭、以2ml/min 的恒速滴入CTS和CAP的混合溶液中，直至藍色乳光，繼續攪拌30min，即得CTS-CAP-MP混懸液。將上述CTS-CAP-MP混懸液在15000r/min的條件下離心20min，取上清液A用 4mol/l的NaOH調pH值至7. 0，使未形成MP的CTS沉淀；然后在15000rpm/min條件下離心 5min得上清液B，取5ml上清液B置于蒸發皿中，55°C水浴蒸干，加入適量甲醇復溶后定容于2ml容量瓶中，0. 22 μ m濾膜過濾后，用高效液相色譜法測定未被包載的游離CAP含量。3.色譜條件與系統適應性實驗色譜柱為DiamonsilC18 (250mmX 4. 6mm，5 μ m)，流動相為甲醇-水(68 32，體積比)，紫外檢測波長為^lnm,流速為l.Oml/min，柱溫為30°C，進樣量為20μ 1。CAP和樣品中相鄰色譜峰的分離度大于1. 5 ；CAP保留時間為16. 55min，理論塔板數以CAP峰計算不低于6000，拖尾因子1. 01，峰形對稱，色譜圖見附圖2和附圖3所示。4.專屬性考察實驗分別制備標準品溶液、CTS-CAP-MP供試品溶液和不含CAP的CTS-MP陰性樣品溶液，在選定的色譜條件下測定，考察輔料對CAP含量測定的干擾情況。實驗結果見附圖4所示的專屬性HPLC色譜圖，其中1為陰性對照，2為CAP樣品，3為CAP標準品。由附圖4可見，通過對空白輔料陰性對照溶液、CAP對照品溶液和CAP樣品溶液在相同色譜條件下分析發現，輔料對CAP的測定無干擾，專屬性良好。5.標準曲線精密稱取CAP標準品15. 75mg (五氧化二磷干燥)，適量甲醇溶解，定容于IOOml 容量瓶中，制成標準品儲備液。分別量取不同體積標準儲備液，定容于IOml容量瓶中配制成濃度分別為 10. 50 μ g/ml、21. OO μ g/ml、42. OO μ g/ml、63. OO μ g/ml、84. OO μ g/ml、 131. 25 μ g/ml、157. 50 μ g/ml的標準溶液。在所述的色譜條件下，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。CAP的標準曲線見附圖5所示，以峰面積對濃度進行線性回歸，得回歸方程y = 0. 1770x+0. 0027，R2 = 0. 9999。結果表明CAP的檢測濃度在10. 5 157. 5 μ g/ml范圍內與峰面積呈良好線性關系。6.精密度試驗選取高中低三個不同濃度的標準品溶液，進樣20 μ 1，按照選定色譜條件每個標準品溶液測定6次，統計峰面積并計算相對標準偏差(RSD)。實驗結果見表1，表中數據顯示在 21. OO μ g/ml、63. OO μ g/ml 和 131. 25 μ g/ml 高中低三個濃度下 RSD 分別為 0. 23%,0. 33% 和0. 19%，且均小于0. 5%，表明本方法具有好的進樣精密度。表1精密度試驗結果(n = 6)
權利要求
1.一種殼聚糖載辣椒素微球的制備方法，其特征在于通過離子交聯法聯合噴霧干燥法制備得到，包括以下步驟(1)采用醋酸溶液充分溶解殼聚糖，配制成ι.O mg/ml的殼聚糖溶液； 采用吐溫-80溶液溶解辣椒素，配制成1. 5mg/ml的辣椒素溶液；(2)將步驟(1)所述殼聚糖溶液和辣椒素溶液按照10:1的體積比混勻得混合溶液；(3)將三聚磷酸鈉水溶液加入步驟(2)所述混合溶液中得載辣椒素的殼聚糖微球混懸溶液；(4)將步驟(3)所述載辣椒素的殼聚糖微球混懸溶液，放置至無氣泡，用噴霧干燥機進行噴霧干燥。
2.根據權利要求1所述殼聚糖載辣椒素微球的制備方法，其特征在于步驟(1)所述醋酸溶液的濃度為1% ；所述吐溫-80溶液濃度為0. 5%。
3.根據權利要求1所述殼聚糖載辣椒素微球的制備方法，其特征在于步驟(2)所述混合溶液的PH值調節為4.5。
4.根據權利要求1所述殼聚糖載辣椒素微球的制備方法，其特征在于步驟(3)是在攪拌條件下，將濃度為1%的三聚磷酸鈉水溶液恒速滴入步驟(2)所述混合溶液中，至藍色乳光出現，繼續攪拌即得載辣椒素的殼聚糖微球混懸溶液；步驟(4)所述噴霧干燥的工藝條件為熱風量32 m3/h，進樣速率400 ml/h，壓縮空氣壓力10 Ι/min，進風口的溫度為160°C， 進樣速率為600 ml/h。
5.一種權利要求1、2、3或4所述殼聚糖載辣椒素微球的制備方法制備得到的殼聚糖載辣椒素微球。
6.一種權利要求5所述殼聚糖載辣椒素微球在制備緩釋制劑方面的應用。
7.—種權利要求5所述殼聚糖載辣椒素微球在制備減肥藥物或保健品方面的應用。
8.—種權利要求5所述殼聚糖載辣椒素微球在制備控制體重藥物或保健品方面的應用。
9.一種權利要求5所述殼聚糖載辣椒素微球在制備降血脂藥物或保健品方面的應用。
10.一種權利要求5所述殼聚糖載辣椒素微球在制備降血糖藥物或保健品方面的應用。
全文摘要
本發明公開了殼聚糖載辣椒素微球制備方法及微球和減肥降脂以及降糖應用。以殼聚糖溶液和辣椒素溶液為主要原料，通過離子交聯法聯合噴霧干燥法制備得到，殼聚糖和三聚磷酸鈉通過化學鍵牢固的結合并通過二次包覆將辣椒素包載其中。所述微球粒徑分布在0.8μm～4.5μm。本發明確定了殼聚糖和辣椒素的包載比例、提供優選的制備工藝條件，對辣椒素實現離子交聯和噴霧干燥過程中的二次包裹作用。所述微球具有良好的緩釋性能，實現殼聚糖和辣椒素的協同增效的減肥、降血脂以及降血糖作用，成功的二次包覆顯著減小辣椒素刺激性；克服了傳統制備載藥微球產量不足、使用有機溶劑、包封率和載藥量不佳等缺陷，具有良好的工業應用意義。
文檔編號A61P3/04GK102293752SQ201110247678
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月26日 優先權日2011年8月26日
發明者蘇政權, 譚思榮, 陶毅, 高冰 申請人:廣東藥學院